Name: Ein modifiziertes Co-Kultursystem zum Verständnis von Granulosa-Theka-Zell-Interaktionen im Rinder-Eierstock (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Erfahren Sie ein modifiziertes Co-Kultursystem für bovine Theka- und Granulosazellen zur Analyse parakriner Signalwege und Substrattransporte im Eierstock. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Untersuchungen follikulärer Dynamiken.

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<ol><li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Forde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrous+cycles+in+Bos+taurus+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Oestrous cycles in Bos taurus cattle.</a> Anim Reprod Sci. 124 (3-4), 163-169 (2011).</li>
<li>Hennet, M. L., Combelles, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antral+follicle%3A+A+microenvironment+for+oocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The antral follicle: A microenvironment for oocyte differentiation.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 819-831 (2012).</li>
<li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+resource%3A+Preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Research resource: Preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Mol Endocrinol. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell Tissue Res. 354, 869-880 (2013).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue+culture+model+of+estrogen-producing+primary+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells.</a> J Vis Exp. (139), e58208(2018).</li>
<li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system%3A+Induction+and+maintenance+of+estradiol+production%2C+response+to+follicle-+stimulating+hormone%2C+and+morphological+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: Induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biol Reprod. 56 (3), 608-616 (1997).</li>
<li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androstenedione+increases+cytochrome+P450+aromatase+messenger+ribonucleic+acid+transcripts+in+non-luteinizing+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Androstenedione increases cytochrome P450 aromatase messenger ribonucleic acid transcripts in non-luteinizing bovine granulosa cells.</a> Mol Reprod Dev. 70, 175-183 (2005).</li>
<li>Chandrasekher, Y. A., Fortune, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxytocin+on+steroidogenesis+by+bovine+theca+and+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxytocin on steroidogenesis by bovine theca and granulosa cells.</a> Endocrinology. 127 (2), 926-933 (1990).</li>
<li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 62 (1), 186-191 (2000).</li>
<li>Gong, J. G., McBride, D., Bramley, T. A., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+recombinant+bovine+somatotrophin%2C+insulin-like+growth+factor-I+and+insulin+on+bovine+granulosa+cell+steroidogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of recombinant bovine somatotrophin, insulin-like growth factor-I and insulin on bovine granulosa cell steroidogenesis in vitro.</a> J Endocrinol. 143 (1), 157-164 (1994).</li>
<li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-lactate+induces+specific+genome-wide+alterations+of+gene+expression+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">L-lactate induces specific genome-wide alterations of gene expression in cultured bovine granulosa cells.</a> BMC Genomics. 20 (1), 273(2019).</li>
<li>Baddela, V. S., Sharma, A., Plinski, C., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+protects+granulosa+cells+from+oleic+acid+induced+steatosis+and+rescues+progesterone+production+via+cAMP+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Biol+Lipids%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid protects granulosa cells from oleic acid induced steatosis and rescues progesterone production via cAMP dependent mechanism.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1867 (8), 159159(2022).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+free+fatty+acids+affect+bovine+granulosa+cell+function%3A+a+molecular+cue+for+compromised+reproduction+during+negative+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Connect%22%5BJournal%5D)">Elevated free fatty acids affect bovine granulosa cell function: a molecular cue for compromised reproduction during negative energy balance.</a> Endocr Connect. 8 (5), 493-505 (2019).</li>
<li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+oestrogen+synthesis+-+The+two-cell%2C+two-+gonadotrophin+model+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Follicular oestrogen synthesis - The two-cell, two- gonadotrophin model revisited.</a> Mol Cell Endocrinol. 100, 51-54 (1994).</li>
<li>Campen, K. A., Lavallee, M., Combelles, C. M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bisphenol+S+on+bovine+granulosa+and+theca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">The impact of bisphenol S on bovine granulosa and theca cells.</a> Reprod Domest Anim. 53 (2), 450-457 (2018).</li>
<li>Glister, C., Richards, S. L., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+%28BMP%29+-4%2C+-6%2C+and+-7+potently+suppress+basal+and+luteinizing+hormone-induced+androgen+production+by+bovine+theca+interna+cells+in+primary+culture%3A+could+ovarian+hyperandrogenic+dysfunction+be+caused+by+a+defect+in+thecal+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins (BMP) -4, -6, and -7 potently suppress basal and luteinizing hormone-induced androgen production by bovine theca interna cells in primary culture: could ovarian hyperandrogenic dysfunction be caused by a defect in thecal BMP signaling.</a> Endocrinology. 146 (4), 1883-1892 (2005).</li>
<li>Wrathall, J. H., Knight, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibin-related+peptides+and+oestradiol+on+androstenedione+and+progesterone+secretion+by+bovine+theca+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibin-related peptides and oestradiol on androstenedione and progesterone secretion by bovine theca cells in vitro.</a> J Endocrinol. 145 (3), 491-500 (1995).</li>
<li>Shores, E. M., Picton, H. M., Hunter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+pig+theca+cell+steroidogenesis+by+LH%2C+insulin-like+growth+factor+I+and+granulosa+cells+in+serum-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of pig theca cell steroidogenesis by LH, insulin-like growth factor I and granulosa cells in serum-free culture.</a> J Reprod Fertil. 118 (2), 211-219 (2000).</li>
<li>Gregoraszczuk, E. L., Ptak, A., Karniewska, M., Ropstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+defined+mixtures+of+PCBs%2C+p%2Cp%27-DDT+and+its+metabolite+p%2Cp%27-DDE%2C+on+co-culture+of+porcine+theca+and+granulosa+cells%3A+steroid+secretion%2C+cell+proliferation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Action of defined mixtures of PCBs, p,p'-DDT and its metabolite p,p'-DDE, on co-culture of porcine theca and granulosa cells: steroid secretion, cell proliferation and apoptosis.</a> Reprod Toxicol. 26 (2), 170-174 (2008).</li>
<li>Rak, A., Drwal, E., Wróbel, A., Gregoraszczuk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistin+is+a+survival+factor+for+porcine+ovarian+follicular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Resistin is a survival factor for porcine ovarian follicular cells.</a> Reproduction. 150 (4), 343-355 (2015).</li>
<li>Kotsuji, F., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The role of granulosa and theca cell interactions in ovarian structure and function.</a> Microsc Res Tech. 27 (2), 97-107 (1994).</li>
<li>Orisaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+granulosa+cell+differentiation+during+gonadotropin-independent+follicular+growth+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on granulosa cell differentiation during gonadotropin-independent follicular growth in cattle.</a> Mol Reprod Dev. 73 (6), 737-744 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+granulosa+and+theca+cell+interactions+in+ovarian+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Role of granulosa and theca cell interactions in ovarian follicular maturation.</a> Microsc Res Tech. 69 (6), 450-458 (2006).</li>
<li>Tajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ovarian+theca+cells+on+apoptosis+and+proliferation+of+granulosa+cells%3A+changes+during+bovine+follicular+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ovarian theca cells on apoptosis and proliferation of granulosa cells: changes during bovine follicular maturation.</a> Biol Reprod. 66 (6), 1635-1639 (2002).</li>
<li>Allegrucci, C., Hunter, M. G., Webb, R., Luck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bovine+granulosa+and+theca+cells+in+a+novel+serum-free+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interaction of bovine granulosa and theca cells in a novel serum-free co-culture system.</a> Reproduction. 126 (4), 527-538 (2003).</li>
<li>Santaguida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+by+side+comparison+between+dynamic+versus+static+models+of+blood-brain+barrier+in+vitro%3A+A+permeability+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: A permeability study.</a> Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolated+Brain+Microvessel%3A+A+Versatile+Experimental+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Isolated Brain Microvessel: A Versatile Experimental Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Front Physiol. 11, 398(2020).</li>
<li>Schneider, F., Brüssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reprod Fertil Dev. 18 (8), 857-866 (2006).</li>
<li>Nimz, M., Spitschak, M., Schneider, F., Fürbass, R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+genes+encoding+steroidogenic+enzymes+and+hormone+receptors+in+late+preovulatory+follicles+of+the+cow+coincides+with+an+accumulation+of+intrafollicular+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of genes encoding steroidogenic enzymes and hormone receptors in late preovulatory follicles of the cow coincides with an accumulation of intrafollicular steroids.</a> Domest Anim Endocrinol. 37, 45-54 (2009).</li>
<li>Amsterdam, A., May, J. V., Schomberg, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+insulin+and+follicle-stimulating+hormone+on+biochemical+and+morphological+differentiation+of+porcine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of insulin and follicle-stimulating hormone on biochemical and morphological differentiation of porcine granulosa cells in vitro.</a> Biol Reprod. 39 (2), 379-390 (1988).</li>
<li>Monga, R., Sharma, I., Datta, T. K., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+serum-free+buffalo+granulosa+cell+culture+and+analysis+of+genes+involved+in+terminal+differentiation+from+FSH-+to+LH-responsive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Domest+Anim+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Characterization of serum-free buffalo granulosa cell culture and analysis of genes involved in terminal differentiation from FSH- to LH-responsive phenotype.</a> Domest Anim Endocrinol. 41 (4), 195-206 (2011).</li>
<li>Bao, B., Garverick, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+steroidogenic+enzyme+and+gonadotropin+receptor+genes+in+bovine+follicles+during+ovarian+follicular+waves%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of steroidogenic enzyme and gonadotropin receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves: A review.</a> J Anim Sci. 76 (7), 1903-1921 (1998).</li>
<li>Bao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+messenger+ribonucleic+acid+encoding+luteinizing+hormone+receptor%2C+cytochrome+P450+side+chain+cleavage%2C+and+aromatase+are+associated+with+recruitment+and+selection+of+bovine+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Changes in messenger ribonucleic acid encoding luteinizing hormone receptor, cytochrome P450 side chain cleavage, and aromatase are associated with recruitment and selection of bovine ovarian follicles.</a> Biol Reprod. 56 (5), 1158-1168 (1997).</li>
<li>Orisaka, M., Tajima, K., Tsang, B. K., Kotsuji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa-theca+cell+interactions+during+preantral+follicular+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ovarian.+Res%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa-theca cell interactions during preantral follicular development.</a> J. Ovarian. Res. 2 (1), 9(2009).</li>
<li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li>
<li>Kotsuji, F., Kamitani, N., Goto, K., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+theca+and+granulosa+cell+interactions+modulate+their+growth%2C+morphology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bovine theca and granulosa cell interactions modulate their growth, morphology, and function.</a> Biol Reprod. 43 (5), 726-732 (1990).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x Hank's Balanced Salt Solution HBSS (w Mg/Ca, Phenolrot)</td><td>Bio& Bio Verkaufen</td><td>BS. Nr. L201-10</td><td>in Reinstwasser auflösen; Stellen Sie den pH-Wert der Aufschlusslösung (HBSS und HEPES) auf 7,4 ein und führen Sie vor der Verwendung eine Sterilfiltration durch</td></tr><tr><td>18 G Nadel, 40 mm, Durchmesser 1,2 mm</td><td>Roth</td><td>281T.1</td><td>Einwegnadel, kurzer Schnitt</td></tr><tr><td>3 ml Spritze (Omnifix Luer)</td><td>Roth</td><td>LY22.1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Merck</td><td>Nr. A6964</td><td>Firmenzweig: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Amphotericin B (250 &micro; g/ml)</td><td>Bio& Bio Verkaufen</td><td>BS. AB17.01050</td><td></td></tr><tr><td>Androstendion</td><td>Merck</td><td>46033</td><td>Wir verwenden eine Stammlösung von 10 mM, verdünnt in 100 % Ethanol; Filiale: Supelco</td></tr><tr><td>Fernglas Carl Zeiss Technival2</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>nicht zutreffend</td><td>in Verbindung mit Auflicht Schott KL 1600 LED</td></tr><tr><td>BSA (5 %)</td><td>Merck</td><td>Nr. A3311</td><td>Firmenzweig: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Zellsieb (100 & Mikro; M Porengröße)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3945.100</td><td>passend für 50 ml Zentrifugationsröhrchen</td></tr><tr><td>Kollagen R (0,2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase NB8 (10%)</td><td>Nordmark</td><td>S1745601</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX Behälter zum Einfrieren von Zellen&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CLS432002</td><td>Produkt von Corning</td></tr><tr><td>Fläschchen zur Kryokonservierung (2 ml)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP89020</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschale, 12 Wells, flacher Boden</td><td>TPP Faust</td><td>TPP92112</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschale, 24 Wells, flacher Boden</td><td>TPP Faust</td><td>TPP92424</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschale, 6 Vertiefungen, flacher Boden</td><td>TPP Faust</td><td>TPP92006</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ohne Ca2+, Mg2+</td><td>Bio& Bio Verkaufen</td><td>BS. Nr. L182-10</td><td>Vor Gebrauch in Reinstwasser auflösen und autoklavieren</td></tr><tr><td>Östradiol, 17b-[2,4,6,7-3H]</td><td>Hartmann Analytik</td><td>ART1555</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS Superior stabil)</td><td>Bio& Bio Verkaufen</td><td>FBS. Nr. S0615</td><td></td></tr><tr><td>FSH (~7.000 IE/mg; aus menschlicher Hypophyse)</td><td>Merck</td><td>Nr. F4021</td><td>Wir bevorzugen eine Stammlösung von 2 & micro; g/ml, verdünnt in 0,9 % NaCl; Firmenzweig: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>hängende Zellkultureinsätze (0,4 &Mikro; M Porengröße)</td><td>cellQART</td><td>9320412</td><td>Achten Sie bei der Bestellung auf die unterschiedlichen Eigenschaften von Beilagen. wir bevorzugen eine klare PET-Membran für die Phasenkontrastmikroskopie</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Roth</td><td>9105.2</td><td>Stellen Sie den pH-Wert der Aufschlusslösung (HBSS und HEPES) auf 7,4 ein und führen Sie vor der Verwendung eine Sterilfiltration durch</td></tr><tr><td>Holo-Transferrin (Rinder)</td><td>Merck</td><td>Nr. T1283</td><td>in sterilem Wasser auflösen; Firmenzweig: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>innuPREP RNA Mini Kit 2.0</td><td>IST innuscreen</td><td>Artikel-Nr.: 845-KS-2040250</td><td></td></tr><tr><td>Insulin (10 mg/ml; aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders)</td><td>Merck</td><td>Nr. I0516</td><td>in 1x PBS auflösen; Firmenzweig: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Bio& Bio Verkaufen</td><td>BS. Nr. K0283</td><td></td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Merck</td><td>Nr. I1146</td><td>Wir verwenden eine Stammlösung von 200 & Mikro; g/ml, gelöst in 10 mM HCl und 1x PBS mit 1 mg/ml BSA; Firmenzweig: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektralphotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>nicht zutreffend</td><td>Messung der RNA-Konzentration</td></tr><tr><td>NEA (100-fach)</td><td>Bio& Bio Verkaufen</td><td>BS. Nr. K0293</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10.000 IE/10 mg/ml)</td><td>Bio& Bio Verkaufen</td><td>BS. Nr. A2213</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes Wasser, geeignet für Zellkulturen</td><td>Merck</td><td>W3500</td><td>Firmenzweig: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>SensiFAST cDNA-Synthese-Kit</td><td>Biolinie</td><td>BIO-65054</td><td>Lieferung über den Vertriebspartner BioCat</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (7,5%)</td><td>Bio& Bio Verkaufen</td><td>BS. Nr. L1713</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Merck</td><td>Nr. S9133</td><td>in sterilem Wasser auflösen; Firmenzweig: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Thermoschüttler TS-100C</td><td>Fischer Scientific</td><td>12357627</td><td>in Verbindung mit HC18-Block (Kat.-Nr. 12337627)</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Bio& Bio Verkaufen</td><td>BS. Nr. F0915</td><td></td></tr></tbody></table>

ein modifiziertes co-kultursystem zum verständnis von granulosa-theka-zell-interaktionen im rinder-eierstock

A Modified Co-Culture System for Understanding Granulosa-Theca Cell Interactions in the Bovine Ovary

Obwohl TCs und GCs mit etablierten mechanischen Trenntechniken isoliert wurden, die auf follikulärer Kompartimentierung basieren, wurde die Expression von zelltypspezifischen Genen CYP17A1 und CYP19A1 untersucht, um das Risiko einer Kreuzkontamination auszuschließen. CYP17A1 wurde ausschließlich in frisch isolierten TCs exprimiert, während CYP19A1 überwiegend in frisch isolierten GCs exprimiert wurde (Abbildung 2).
Das Co-Kultur-System ermöglicht die Kompartimentierung von bovinen Theka- und Granulosazellen auf gegenüberliegenden Seiten eines Membraninserts und ahmt dadurch die räumliche Organisation in vivo nach. Nach drei Tagen in Kultur zeigten die TCs eine abgeflachte und längliche Morphologie, als sie sich über die Oberfläche der kollagenbeschichteten Insertmembran ausbreiteten, was auf eine erfolgreiche Anheftung hinweist (Abbildung 3A). Wenn sie über den gesamten Zeitraum von 9 Tagen allein kultiviert wurden, vermehrten sich die TCs weiter und erreichten am 9. Tag die Konfluenz (Abbildung 3B). Im Gegensatz dazu entwickelten GCs, die allein 6 Tage lang auf der kollagenbeschichteten Insertmembran kultiviert wurden, einen Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp, der für GCs in vitro charakteristisch ist (Abbildung 3C). Darüber hinaus neigten GCs, wie zuvor beschrieben, dazu, Cluster zu bilden, ein typisches Merkmal dieser Zellen in Kultur 5,7,31,32. Im Co-Kultursystem wurden weder bei TCs noch bei GCs im Vergleich zu ihren jeweiligen zeitlich angepassten Monokulturen offensichtliche morphologische Unterschiede beobachtet (Abbildung 3D), was darauf hindeutet, dass die insertbasierte Umgebung ein normales zelluläres Verhalten beibehält. Aufgrund technischer Einschränkungen bleibt die mikroskopische Bewertung der Co-Kultur jedoch eine Herausforderung, insbesondere bei der Unterscheidung und Beurteilung der TC-Morphologie unabhängig von den anderen Zellen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wird derzeit ein optimiertes Protokoll für die Zellfixierung entwickelt, indem alternative Strategien zur Zellidentifizierung in Abwesenheit von zellspezifischen Antikörpern für die Immunfärbung erforscht werden.
Die Funktionalität des Co-Kultursystems wurde durch die Analyse der Hormonproduktion und der Expression von Schlüsselmarkergenen für TCs und GCsbewertet 33,34, was die zelltypspezifische steroidogene Rolle bestätigte. Ein Vergleich zwischen dem GC-Monokultur- und dem Co-Kulturmodell ergab ähnliche Östradiol (E2)-Werte, die in vitro produziert wurden. Wie erwartet produzierte die TC-Monokultur jedoch nur vernachlässigbare Mengen an E2, was mit der 2-Zell-2-Gonadotropin-Hypothese (Abbildung 4A)15 übereinstimmt, die besagt, dass Thekazellen nicht in der Lage sind, E2 unabhängig zu synthetisieren.
Um die physiologische Relevanz der Kulturbedingungen weiter zu bewerten, wurde die Expression von Schlüsselmarkergenen33 untersucht. In Übereinstimmung mit der 2-Zell-2-Gonadotropin-Hypothese wurde CYP19A1 überwiegend in GCs exprimiert, während CYP17A1 hauptsächlich in TCs nachgewiesen wurde, ein Muster, das sowohl unter Mono- als auch unter Co-Kulturbedingungen beobachtet wurde (Abbildung 4B,C). Bemerkenswert ist, dass die Transkripthäufigkeit von CYP19A1 in GCs innerhalb des Co-Kultursystems im Vergleich zur GC-Monokultur höher war, obwohl keine Unterschiede in den Östradiolkonzentrationen beobachtet wurden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Zellkulturaufbaus. (A) Ein Diagramm, das die speziell angefertigte Impfkammer veranschaulicht, in der ein abgeschnittenes Röhrchen auf dem umgedrehten Einsatz verwendet wird, um ein Austreten des Mediums während der anfänglichen Kulturperiode zu verhindern. (B) Zeitplan des experimentellen Verfahrens: TCs wurden drei Tage lang auf dem invertierten Insert kultiviert, um eine Bindung zu ermöglichen. Das Insert wurde umgedreht und die GCs wurden auf der gegenüberliegenden Seite ausgesät, gefolgt von weiteren sechs Tagen Kultur. Die Studie verglich TCs und GCs, die getrennt mit dem TC-GC-Co-Kultursystem kultiviert wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Genexpression von zelltypspezifischen Markern in frisch isolierten Granulosa- und Thekazellen. (A) CYP17A1 wurde ausschließlich in TCs exprimiert, während (B) CYP19A1 überwiegend in GCs nachgewiesen wurde, was die Spezifität und anfängliche Reinheit der isolierten Zellpopulationen vor der Kultur bestätigt. Die Daten werden als relative Expression normiert zum geometrischen Mittel der Referenzgene RPLP0 und TBP dargestellt. Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte sind dargestellt, die Daten wurden auf Normalität und Varianz getestet, Sternchen zeigen signifikante Unterschiede an (n=3, t-Test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Morphologie von Theka- und Granulosazellen in Kultur. (A) TCs, die 3 Tage lang kultiviert wurden, wurden an die kollagenbeschichtete Insertmembran gebunden. (B) TCs wuchsen nach dem gesamten 9-Tage-Zeitraum in der Monokultur zu einem Zusammenfluss. (C) GCs zeigen nach 6 Tagen in Kultur den typischen Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp. (D) Die Kokultur von TC und GC zeigt keinen offensichtlichen morphologischen Unterschied im Vergleich zu den jeweiligen zeitlich angepassten Monokulturen. Dieses Bild wurde nach 6 Tagen GC-Kultur und 9 Tagen TC-Kultur (am Endpunkt des Co-Kultur-Experiments) aufgenommen. Maßstabsstäbe 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68589/68589fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Analyse der funktionellen Marker im Co-Kultursystem. (A) Die Hormonkonzentrationen von Östradiol (E2) bestätigen die physiologische Funktionalität des Zellkultursystems. (B, C) Die Genexpressionsanalyse des TC-Markers CYP17A1 und des GC-Markers zeigt CYP19A1 die Identität und den Funktionszustand beider Zellpopulationen. Zur Berechnung der relativen Expression wurde das geometrische Mittel der Referenzgene RPLP0 und TBP verwendet. Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte sind dargestellt, die Daten wurden auf Normalität und Varianz getestet, Sternchen zeigen signifikante Unterschiede an (n=3, einfache ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68589/68589fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Ein modifiziertes Co-Kultursystem zum Verständnis von Granulosa-Theka-Zell-Interaktionen im Rinder-Eierstock

A reliable co-culture of granulosa (GCs) and theca cells (TCs) has the potential to facilitate a more comprehensive understanding of the interactions, ...

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Biology

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