Expansionsmikroskopie: Hochauflösende fluoreszierende Bildgebung mit einem herkömmlichen Mikroskop

Wir sind Zellbiologen und untersuchen die Rolle von Mikrotubuli und deren zugehörige Funktion in verschiedenen Modellorganismen. Wir wollen ihre Rolle bei der zellulären Organisation, Morphogenese, Ziliogenese und Teilung untersuchen. In den letzten fünf Jahren haben wir zum Verständnis der zirkulären molekularen Zusammensetzung beigetragen, insbesondere durch den Einsatz von Expansionsmikroskopie.

Und damit offenbaren wir das Schlüsselmerkmal ihrer Assemblierung und Funktion. Durch die Kombination von Expansionsmikroskopie mit Kryofixierung ermöglicht unser Protokoll hochauflösende Bildgebung bei gleichzeitiger Erhaltung der nahezu nativen Struktur des zellulären Elements, was die Haupteinschränkung der Superauflösungsmikroskopie überwindet. Die Expansionsmikroskopie ist eine kostengünstige und einfach umzusetzende Technik, die dem gesamten Labor Zugang zur Superauflösung ermöglicht.

Zu Beginn benutzen Sie eine Spritze und eine Nadel, um jedes Fünf-Milliliter-Rohr mit einem Milliliter extra trockenem Aceton unter einer chemischen Haube zu füllen. Stellen Sie die Schläuche aufrecht in ein Metallgitter und legen Sie sie in flüssigen Stickstoff zum Einfrieren. Füllen Sie die Hälfte einer 30 mal 30 Zentimeter großen, dickwandigen Polystyrolbox mit Trockeneis und füllen Sie dann den Vitrobot-ähnlichen Dewar mit flüssigem Stickstoff, bis die Verdunstung stoppt.

Jetzt entferne die Spinne aus dem Tauchvorrichtung und fülle die metallische Tauchkammer mit flüssigem Ethan. Warte 10 Minuten, damit das Ethan das Gleichgewicht erreicht. Nimm dann einen 12-Millimeter-Deckzettel mit dünner Pinzette und tupfe ihn auf ein Seidenpapier, um überschüssiges Medium vom Deckzettel aufzusaugen.

Halten Sie den Deckschild halb fest und verwenden Sie eine Pinzette, die mit einem Klemmring ausgestattet ist, der mit dem Kryo-Kolben kompatibel ist. Legen Sie die Pinzette, die den Deckdeckel hält, in den Kryo-Pümpelhalter und verwenden Sie Whatman-Papier, um restliches Medium abzutupfen. Aktiviere den Kryo-Kolben, um den Deckdeckel in die Ethanlösung in der Metallkammer zu tauchen.

Dann werden die Deckschicht schnell in das Rohr mit gefrorenem Aceton übertragen. Inkubieren Sie die Röhren mit den Deckschichten in Trockeneis in einem Winkel von etwa 45 Grad. Stellen Sie den geschlossenen Behälter auf einen Orbitalshaker, der auf 50 bis 100 U/min eingestellt ist, und bewegen Sie über Nacht bei vier Grad Celsius, damit die Temperatur allmählich steigen kann.

Entferne als Nächstes den Großteil des Trockeneis aus der Box. Setzen Sie die Bewegung am Orbitalschütter weitere 45 Minuten fort, damit die Temperatur von minus 80 Grad Celsius auf minus 20 Grad Celsius steigen kann. Öffne und schließe jedes Rohr kurz, um den Innendruck abzulassen.

Anschließend wird jeder Deckmantel auf eine 12-Well-Platte oder einen geeigneten Behälter übertragen, der mit vorgekühlter 100%iger Ethanollösung vorgefüllt ist. Nach einer fünfminütigen Inkubation werden die Coverslips durch eine graduierte Ethanolserie rehydriert. Nachdem Sie die Deckzettel in PBS übertragen haben, legen Sie sie unter ein Mikroskop.

Mit einer feinen Pinzette kratzen Sie vorsichtig an der Oberfläche und richten Sie alle Überdeckungen mit der richtigen Seite nach oben aus. Legen Sie die Deckblätter in eine Platte mit vier Brunnen, gefüllt mit 0,5 bis einem Milliliter 2%-Acrylamid- und 1,4%-Formaldehydlösung in PBS. Dann inkubieren Sie die Deckfolien in dieser Lösung bei 37 Grad Celsius ohne Rührung.

Als Nächstes 10 % APS auftauen und die Gelationslösung 10 Minuten lang auf Eis lassen, bevor sie geliert wird. Bereiten Sie eine feuchte Kammer mit einer dünnen Schicht Nassgewebe und Parafilm vor. Dann lagern Sie es bei vier Grad Celsius.

Nach 10 Minuten wird die feuchte Kammer auf einen kalten Block gelegt, um sie während der Gelierung zu verwenden. Entferne nun die Überdeckfolien aus der Proteinverankerungslösung und tupfe überschüssige Flüssigkeit mit Seidenpapier in zwei aufeinanderfolgenden Durchgängen ab. APS zur Gelationslösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,5 % und einen Wirbel für zwei bis drei Sekunden zu erreichen.

Dann pipettieren Sie zwei 35-Mikroliter-Tropfen auf den Parafilm in der feuchten Kammer und legen Sie vorsichtig jeden Deckmantel über einen Tropfen, wobei die Zellen nach unten in die Gelationslösung zeigen. Übertragen Sie die feuchte Kammer für 30 bis 60 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Für die Denaturierung verwenden Sie ein Biopsie-Lochwerkzeug mit 0,4 Zentimeter Durchmesser, um Gelstücke zu extrahieren, und legen Sie sie in eine Sechs-Wellen-Platte, die mit einem Milliliter Denaturationspuffer gefüllt ist.

Rühren Sie die Platte 10 bis 15 Minuten lang, bis sich die Gele von den Deckschichten lösen, und übertragen Sie die abgetrennten Gelstücke in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren, die mit frischem Denaturationspuffer gefüllt sind. Inkubieren Sie die Gels 90 Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Nach der Inkubation werden die Gele für 10 Minuten in doppelt destilliertes Wasser zum Waschen gefasst.

Messen Sie den Durchmesser der Gele mit Millimeterpapier, um den Gel-Ausdehnungsfaktor zu berechnen. Saubere Deckschichten mit etwa 200 Mikrolitern Polylysinlösung beschichten. Inkubieren Sie die Deckfolien eine Stunde lang bei Zimmertemperatur und waschen Sie sie dann dreimal mit doppelt destilliertem Wasser, um überschüssiges Polylysin zu entfernen.

Nachdem die Überdeckfolien getrocknet sind, werden sie bis zur nächsten Nutzung bei vier Grad Celsius aufbewahrt. Legen Sie das Gel richtig ausgerichtet, mit den Zellen nach oben, auf fusselfreies Papier und lassen Sie es trocknen, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Zum Schluss montieren Sie die getrockneten Gele mit den Zellen nach unten auf Poly-D-Lysin-beschichtete Deckschichten.

Die Kryofixierung erhielt das mitochondriale Netzwerk in RPE1-Zellen effektiver als die PFA-Fixierung, wie die NHS-Ester- und ATP5A-Färbung zeigen, und ermöglichte die Auflösung der mitochondrialen Cristae, die bei PFA-Fixierung nicht sichtbar waren. Die Kryofixierung führte zu einer besseren Erhaltung dynamischer Mikrotubuli, einschließlich zytoplasmatischer und astraler Mikrotubuli in mitotischen RPE1-Zellen, im Vergleich zur PFA-Fixierung. Trypanosoma brucei, Kryofixierung, bewahrte die Architektur des Mitochondrions und die allgemeine Zellstruktur besser im Vergleich zur PFA-Fixierung, wie sie mit TDH- und NHS-Esterfärbung sichtbar ist.

Außerdem hat die Kryofixierung das endoplasmatische Retikulum besser erhalten als die PFA-Fixierung basierend auf BIP-Färbung. Risse wurden in kryofixierten RPE1-Zellen beobachtet, aber diese störten nicht die Ultrastruktur von Organellen wie Mitochondrien oder Mikrotubuli. Eine schlechte Kryofixierung zeigte sich durch blasenartige Strukturen und wellenförmige Mikrotubuli sowie durch den Verlust der membranösen Organellenintegrität.

Die Ausdehnungsqualität hing von der Klarheit von Natriumacrylatlösungen ab, wobei verwendbare Lösungen farblos oder leicht gelb und durchsichtig wirkten, während unbrauchbare Lösungen trüb und orange wirkten.