Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Willkommen im Labor von Dr.Hiku Alge Blink. Wir danken dem California Institute of Regenerative Medicine für die Finanzierung dieses Projekts. Die Markierung von Stammzellen mit fluoreszierendem Kontrastmittel ermöglicht eine in vivo Nachverfolgung von transplantierten Stammzellen in vivo.

Die anschließende optische Bildgebung der markierten Stammzellen ermöglicht Längsschnittstudien, bei denen die Migration der Zellen in vivo nicht-invasiv überwacht werden kann. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie sowohl humane embryonale Stammzellen als auch menschliche mesenchymale Stammzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen markieren können. Hallo, ich bin Sophie Boddington von der Contrast Agent Research Group in der Abteilung für Radiologie an der University of California in San Francisco.

Heute möchte ich Ihnen zwei verschiedene Techniken zur Markierung von Stammzellen mit fluoreszierenden Kontrastmitteln vorstellen. Eine zur Markierung mesenchymaler Stammzellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff DID und eine weitere zur Markierung menschlicher embryonaler Stammzellen mit endign ingra. Lassen Sie mich Ihnen zunächst unsere Technik zur Markierung menschlicher mesenchymaler Stammzellen mit DIS vorstellen.

Um mit der Markierung mesenchymaler Stammzellen zu beginnen, müssen wir versuchen, sie zu anisieren und zu zählen, um eine Suspension mit einer definierten Anzahl von Zellen zu erhalten. Da es sich hierbei um eine Standard-Gewebekulturtechnik handelt, werden wir sie nicht im Detail vorstellen. Wir wollen die Zellen, die wir mit einer Dichte von 1 Million Zellen pro Milliliter markieren, in serumfreiem Kulturmedium suspendieren.

Zuerst fügen wir fünf Mikroliter DID-Kontrastmittel pro Milliliter Zellsuspension hinzu. Jetzt mischen wir die Lösung durch schonendes Pipettieren und inkubieren die Zellen mit Markierungslösung in einer Sechs-Well-Schale mit niedrigem Aufsatz bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Sobald die einfache Inkubation abgeschlossen ist, müssen wir nun die Zelllösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.

Wir zentrifugieren es fünf Minuten lang bei 400 RCF. Als nächstes saugen wir das Etikettiermedium ab, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht gestört wird. Wir waschen die Zellen nun mit PBS.

Wir pipettieren die Zellen auf und ab und achten darauf, die Zellpalette aufzubrechen. Die beiden letztgenannten Schritte. Wir wiederholen dies noch zwei Mal, so dass wir insgesamt drei Waschschritte haben.

Nun zählen wir die Zellen und führen einen Trip- und Blue-Test durch, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Nachdem Sie die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt haben, können Ihre Zellen nun im optischen Imager abgebildet werden. Um mit der Markierung menschlicher embryonaler Stammzellen zu beginnen, müssen wir zunächst das Kontrastmittel Indocyaningrün vorbereiten.

Dann mischen wir es mit dem Transfektionsmittel Protamin. Zu Beginn messen wir ein Milligramm des Indocyaningrün-Pulvers ab und lösen es in hundert Mikrolitern DMSO auf. Wir fügen der Mischung 400 Mikroliter DMEM mit einem Gehalt von 10 % FCS hinzu und schütteln sie gut, so dass wir eine Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter Indocyaningrün erhalten.

Als nächstes fügen wir das Transfektionsmittel Protamin hinzu, das als Shuttle für das Kontrastmittel fungiert und es ihm ermöglicht, effizienter in die Zelle einzudringen. Nun mischen wir fünf Mikroliter Protaminsulfat zu 10 Milligramm pro Milliliter mit 300 Mikrolitern ICG und 300 Mikrolitern serumfreiem DMEM. Nun schütteln wir die neue transfektierte Lösung fünf Minuten lang, damit sich Komplexe bilden können.

Als nächstes saugen wir das alte Medium ab und geben 10 Milliliter PREWARM DMEM in die Zellen. Wir geben die zuvor vorbereitete Protamin-ICG-Lösung in die Zellen und beginnen die einstündige Inkubation, indem wir die Schale bei 37 Grad Celsius in den Inkubator stellen. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, nehmen wir die Schale aus dem Inkubator, saugen die Markierungslösung ab und waschen die Zellen, indem wir die Schale mit fünf Millilitern PBS spülen.

Anschließend werden die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius tryps-inisiert. Das Schütteln der Schale hilft, die Zellen in Suspension zu heben. Nun pipettieren wir vorsichtig auf und ab, um die restlichen Kolonien aufzubrechen.

Wir neutralisieren das Trypsin, indem wir der Schale eine gleiche Menge DMEM mit 10 % FCS hinzufügen. Als nächstes geben wir die Zelllösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren die Lösung fünf Minuten lang bei 400 RCF. Wir resuspendieren die Zellen in Vollmedien.

Wir können jetzt verbleibende Klumpen oder Komplexe entfernen, indem wir die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb führen. Sobald wir eine klumpenfreie Zelllösung haben, saugen wir das alte Medium ab und resuspendieren das Pellet in vorentwurmten, vollständigen humanen embryonalen Stammzellmedien. An diesem Punkt müssen wir die Feeder-Zellen der Maus von den menschlichen embryonalen Stammzellen trennen.

Dies geschieht, um sicherzustellen, dass wir später nur die Stammzellen abbilden. Dazu geben wir die Zelllösung in eine mit Gelatine überzogene 10 Zentimeter große Petrischale. Wir stellen das Gericht in den 37 Grad heißen Inkubator und lassen es 45 Minuten ruhen.

Achten Sie während dieser Zeit darauf, das Gericht nicht zu stören. Jetzt haften die Futtertröge an der Schale und die Stammzellen nicht. Wir übertragen die Lösung aus der Petrischale und haben jetzt eine markierte Einzelzelllösung aus menschlichen embryonalen Stammzellen.

Wir können nun die Zellen zählen und einen Trip-in-Blue-Test an ihnen durchführen. Nachdem die Lebensfähigkeit bestätigt wurde, sind unsere Zellen bereit, abgebildet zu werden. Die Folie zeigt ein Beispiel dafür, wie Stammzellen in vivo in Mäusen sichtbar gemacht werden können, nachdem sie mit einem fluoreszierenden Kontrastmittel markiert und durch eine IP-Injektion verabreicht wurden.

Serielle optische Bildgebungsuntersuchungen zeigten eine anfängliche Ansammlung der Zellen in der Lunge, gefolgt von einer Umverteilung in der Leber, im Knochenmark der Extremitäten und in der Schilddrüse. Die Fluoreszenzmarkierung kann auch für die direkte Darstellung transplantierter Stammzellen in histopathologischen Proben mit Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Stammzellen bei der Zellmarkierung mit fluoreszierenden Kontrastmitteln markieren können.

Es ist wichtig, daran zu denken, jeden Schritt zu standardisieren. Wir tun dies, um eine konsistente Markierungseffizienz und Zellviabilität zu gewährleisten, so dass die Ergebnisse verschiedener Experimente verglichen werden können. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei der Zellmarkierung.