Name: Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Lernen Sie die Markierung von Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven In-vivo-Detektion mittels Optical Imaging. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung transplanterter Zellen in lebenden Organismen.

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Dieses Projekt wurde von einem Leon J. Thal SEED Zuschuss aus dem California Institute for Regenerative Medicine unterstützt. Tobias Henning wurde durch eine Forschung von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HE 4578/1-2) Stipendium finanziert. Wir wollen danken Juanito Meneses für seine Beratung auf die Kultur von humanen embryonalen Stammzellen.

Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff DiD <ol><li> Zu Beginn des Verfahrens zur Kennzeichnung mesenchymale Stammzellen, trypsinize und zählen Sie die Zellen, um eine Suspension mit einer definierten Anzahl von Zellen erhalten. </li><li> Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen aus alten Medien von den Flaschen mit den Zellen markiert werden </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 10 ml Mg / Ca-freiem PBS. Saugen Sie die PBS. Die Mg-und Ca würde hemmen die Trypsin, deshalb verwenden wir PBS ohne diese. </li><li> Add vorgewärmten 0,05% Trypsin, für eine T75-Kolben verwenden wir 5ml. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche des Kolbens bedeckt ist. </li><li> Bei 37 ° C im Brutschrank für ca. 5 Minuten. </li><li> Bestätigen Sie die Ablösung unter dem Mikroskop. Wenn die Zellen noch in den Kolben halten, tippen Sie es ein paar Mal und warten Sie ein wenig länger, bis die Trypsinierung erfolgreich ist. </li><li> Nun ist es notwendig, die Trypsin durch Zugabe von Medium mit 10% FCS zu neutralisieren. Wir verwenden die gleiche Menge von Medien, da es Trypsin. </li><li> Pipette nach oben und unten ein paar Mal, um sicherzustellen, dass alle Zellen in den Medien erneut suspendiert. </li><li> Übertragen Sie die Zell-Lösung zu einer sterilen 15ml capped Polypropylenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 400 rcf für 5 Minuten. </li><li> Absaugen aus dem Überstand die Gewährleistung nicht auf das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren der Zellen in DMEM und fahren Sie mit der Zellzahl. </li><li> Suspend die Zellen bei einer Dichte von 1x10 gekennzeichnet sein ^ 6 pro ml in serumfreiem Kulturmedium (DMEM). </li><li> Das war alles Vorbereitung der Zellsuspension. Nun ist es bereit, die Kennzeichnung zu starten. </li><li> Fügen Sie zuerst 5 ul DiD Kontrastmittel pro ml Zellsuspension. </li><li> Dann mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit der Beschriftung Lösung bei 37 ° C für 20 Minuten in einer 6-well low-Anlage Gericht. </li><li> Sobald die einfache Inkubation abgeschlossen ist, ist es notwendig, die Zell-Lösung in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen verschlossen zu übertragen. </li><li> Centrifuge es sich bei 400 rcf für 5 Minuten. </li><li> Saugen Sie die Kennzeichnung Medium, wodurch nicht Zellpellet stören. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS. Pipette die Zellen auf und ab, und achten Sie darauf brechen die Zellpellet. </li><li> Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte noch zwei weitere Male, so dass es insgesamt 3 Waschschritte. </li><li> Zählen Sie die Zellen und führen Sie eine Trypanblau-Test, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Dies sind Standard-Zellkultur-Protokolle, dass wir nicht hier zu erklären. </li><li> Ihre Zellen sind nun bereit, in der optischen Imager abgebildet werden. </li></ol> Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff ICG <ol><li> Zu Beginn des Verfahrens zur Kennzeichnung menschlicher embryonaler Stammzellen, bereiten das Kontrastmittel Indocyaningrün. Mischen Sie es mit der Transfektionsagens Protamin. </li><li> Messen Sie 1mg der Indocyaningrün Pulver. Lösen Sie die ICG-Pulver in 100 ul Dimethylsulfoxid (DMSO). </li><li> Add 400 ul Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM + 10% fötales Kälberserum) Medien auf die Mischung und schütteln Sie sie gut. Dies führt zu einer finalen Konzentration von 2mg/ml von Indocyaningrün. </li><li> Fügen Sie die Transfektionsagens Protamin. Protamin fungiert als Shuttle für das Kontrastmittel, so dass es in die Zelle wird effizienter. </li><li> Mix 5 ul Protaminsulfat, die bei einer Konzentration von 10mg/ml geliefert wird, mit 300 ul ICG und 300 ul serumfreiem Dulbeccos Modified Eagles Medium. </li><li> Schütteln Sie die neue Transfektion Lösung für 5 Minuten, damit komplexe zu bilden. </li><li> Die Kennzeichnung Lösung bereit ist. </li><li> Saugen Sie die alten Medien von hES-10mm Petrischale. </li><li> Add 5 ml vorgewärmten serumfreien DMEM. </li><li> Fügen Sie die zuvor vorbereiteten Protamin / ICG-Lösung zu den Zellen. Starten Sie die 1 Stunde Inkubation, indem das Gericht in einem Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Schale aus dem Inkubator und saugen die Kennzeichnung Lösung. </li><li> Waschen Sie die Zellen durch Spülen der Teller mit 5 ml PBS. </li><li> Saugen Sie die PBS und ersetzen mit 5 ml 0,25% Trypsin. Inkubieren Sie die Schale bei 37 ° C für 5 Minuten, damit Trypsinierung auftreten. Es hilft, die Schüssel ein wenig hin und wieder schütteln in eine Weile. </li><li> Gently Pipette auf und ab, brechen die restlichen Kolonien. </li><li> Neutralisieren Sie die Trypsin durch Zugabe einer gleichen Menge von KSR, die Schüssel. </li><li> Übertragen Sie die Zelle Lösung für ein 15ml Tube und zentrifugieren die Lösung bei 400 rcf für 5 Minuten. </li><li> Resuspendieren der Zellen in voller Medien. </li><li> Wenn es noch Klumpen an dieser Stelle sind, trypsinize und Zentrifuge wieder. </li><li> Sobald ein Klumpen-freie Zelle Lösung erreicht wird, saugen aus den alten Medien und das Pellet in 10 ml vorgewärmten volle ESC-Medien. </li><li> An dieser Stelle ist es notwendig, die Maus Feeder-Zellen aus dem hESCs trennen. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass später, tritt nur die Abbildung der Stammzellen. </li><li> Dazu übertragen the Zelle Lösung eines Gelatine beschichtete 10 cm Schüssel. </li><li> Setzen Sie die Schüssel in die 37 ° C Inkubator und lassen Sie ihn 45 Minuten lang sitzen. Während dieser Zeit, stellen Sie sicher nicht auf den Teller zu stören. Nun werden die Anleger, die Schüssel halten und die Stammzellen nicht. </li><li> Übertragen Sie die Lösung aus der Petrischale. und jetzt haben wir einen markierten Einzelzellen Lösung von menschlichen embryonalen Stammzellen. </li><li> Die Zellen können nun gezählt werden und eine Trypanblau-Test kann an ihnen durchgeführt werden. </li><li> Die Zellen sind bereit, die abgebildet werden! </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

OI ist ein relativ neues bildgebendes Verfahren, basierend auf der Detektion von Fluoreszenz. OI ist so sensibel wie Radiotracer-basierten Imaging-Techniken, aber nicht mit einer Bestrahlung Exposition verbunden. OI stellt ein wirksames Mittel zur Verfolgung Zellen nicht-invasiv und wiederholt damit einen Einblick in die Zellwanderung an den Zielort. Eine wichtige Einschränkung der Technik ist die begrenzte Eindringen in das Gewebe von fluoreszierenden Sonden in vivo. So ein Tracer Akkumulation im tiefen Gewebe, mehr als etwa 5-10 cm von de...

<table><tbody><tr><td>Indocyanin-Grün (IR-125)</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM, hoher Glukosegehalt</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Mit PBS auf eine Endkonzentration von 0,1 % verdünnen</td></tr><tr><td>PBS, ohne Mg und Ca</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05 %</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25 %</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FCS, charakterisiert</td><td>Reagenz</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb (40 &amp;mu;m Nylon)</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Reagenz</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Knockout-DMEM</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout-Serumersatz</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercapt&amp;#8211;ethanol</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Reagenz</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin 200 mM</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Protaminsulfat</td><td>Reagenz</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

labeling stammzellen mit fluoreszierenden farbstoffen zur nicht-invasiven detektion mit optical imaging

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical Imaging (OI) ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Werkzeug zur In-vivo-Überwachung der neuen Stammzell-basierten Therapien. Die Technik basiert auf ex vivo-Markierung von Stammzellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff, anschließende intravenöse Injektion der markierten Zellen und Visualisierung ihrer Anreicherung in bestimmten Zielorganen oder Pathologien basiert. Die vorgestellte Technik zeigt, wie wir von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) Etikett durch einfache Inkubation mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff DiD (C67H103CIN2O3S) und wie wir humanen embryonalen Stammzellen (hES) Etikett mit der FDA zugelassen Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningrün (ICG). Die Aufnahme-Mechanismus erfolgt über die Einhaltung und Verbreitung der lipophilen Farbstoff in die Phospholipid-Doppelschicht der Zellmembran. Die Kennzeichnung Effizienz ist in der Regel verbessert werden, wenn die Zellen mit dem Farbstoff in serum-freien Medien als der Inkubation in Serum-haltigen Medien Gegensatz bebrütet werden. Darüber hinaus ist der Zusatz des Transfektionsagens Protaminsulfat deutlich verbessert Kontrastmittelaufnahme.

Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Die optische Bildgebung (Optical Imaging, OI) ist ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Instrument zur In-vivo-Überwachung neuer stammzellbasierter Therapien. Die Technik basiert auf der ex vivo ...

Willkommen im Labor von Dr. Hiku Alge Blink. Wir danken dem California Institute of Regenerative Medicine für die Finanzierung dieses Projekts. Die Markierung von Stammzellen mit einem fluoreszenten Kontrastmittel ermöglicht ein In-vivo-Tracking von transplantierten Stammzellen in vivo.Die anschließende optische Bildgebung der markierten Stammzellen ermöglicht Längsschnittstudien, bei denen die Migration der Zellen in vivo nichtinvasiv überwacht werden kann. In diesem Video wird gezeigt, wie man sowohl humane embryonale Stammzellen als auch humane mesenchymale Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Hallo, ich bin Sophie Boddington von der Contrast Agent Research Group in der Abteilung für Radiologie an der University of California in San Francisco.Heute möchte ich Ihnen zwei verschiedene Techniken zur Markierung von Stammzellen mit fluoreszierenden Kontrastmitteln vorstellen. Eine Methode zur Markierung von mesenchymalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff DID und eine weitere zur Markierung von humanen embryonalen Stammzellen mit Endign ingra. Lassen Sie mich damit beginnen, Ihnen unsere Technik zur Markierung humaner mesenchymaler Stammzellen mit DID zu

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Für die Bewertung von neuen Stammzelltherapien ist es wichtig, nicht-invasiv Spur der injizierten Zellen in vivo. Dieses Video zeigt Ihnen, wie Sie humanen mesenchymalen und embryonalen Stammzellen mit Eisenoxid-Kontrastmittel in vivo für die nachfolgenden MR-Bildgebung in vivo-Label.

Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

Wir beschreiben eine Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung von Stammzellen mit FDA-Zulassung, superparamagnetische Eisenoxid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Diese zellulären bildgebendes Verfahren, das Magnetresonanz-(MR)-Bildgebung nutzt zur Visualisierung, ist leicht zugänglich für die langfristige Überwachung und Diagnose von Erfolg oder Misserfolg Stammzellen engraftments bei Patienten.

Labeling Stammzellen mit Ferumoxytol, eine FDA-Zulassung Eisenoxid-Nanopartikel

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

In diesem Artikel beschreiben wir die Prinzipien für das Entwerfen und Durchführen eines mehrfarbigen Abstammungsverfolgungsexperiments mit R26R-Confetti-Mäusen. Wir bieten ein spezifisches Protokoll für die Verfolgung von Hornhautepithelzellen an, das für andere Gewebe von Interesse modifiziert werden kann.

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Durch die Kombination von Zelltransplantation, Zytoskelettmarkierung und Funktionsverlust/-gewinn beschreibt dieses Protokoll, wie die migrierende Zebrafisch-prospektive prächordale Platte verwendet werden kann, um die Funktion eines Kandidatengens bei der in vivo-Zellmigration zu analysieren.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Möglichkeit zur Überwachung der Zelle Persistenz und Bioverteilung des menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen (HaMSCs) durch dunkelrote Fluoreszenz Kennzeichnung in einem Rattenmodell Knie Arthrose (KOA) durch intraartikuläre Injektion (IA).

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

Unter Verwendung menschlicher primärer Prostataepithelzellen berichten wir über eine neuartige biomarkerfreie Methode der funktionellen Charakterisierung von stammähnlichen Zellen durch einen sphäroidbasierten Labelretentionstest. Für die Beschriftung von BrdU-, CFSE- oder Far Red 2D-Zellen wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. dreidimensionale Sphäroidbildung; kennzeichnungserhaltende stammähnliche Zellidentifikation durch Immunzytochemie; isolierung durch FACS.

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Dieses Protokoll beschreibt Strategien zur Identifizierung und Anreicherung des Zellzustands in primären neuralen Stammzellkulturen adulter Mäuse durch Autofluoreszenzbildgebung unter Verwendung i) eines konfokalen Mikroskops, ii) eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers zur Durchführung einer Intensitätsbildgebung oder iii) eines Multiphotonenmikroskops zur Durchführung einer Fluoreszenzlebensdauerbildgebung.

Klassifizierung des Aktivierungszustands neuraler Stammzellen in vitro mittels Autofluoreszenz

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Der Schneidezahn der Maus enthält in seiner Stammzellnische wertvolle markierungshaltende Zellen. Wir haben eine neuartige Methode, um die markierungserhaltenden Zellen unvoreingenommen zu erkennen und zu quantifizieren. Unsere Studie verwendete eine EdU-Markierung und einen 3D-Rekonstruktionsansatz nach der PEGASOS-Gewebereinigung des Unterkiefers.

Detektion und Quantifizierung von markierungshaltenden Zellen in Schneidezähnen von Mäusen mittels eines 3D-Rekonstruktionsansatzes nach Gewebereinigung

Lernen Sie die Markierung von Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven In-vivo-Detektion mittels Optical Imaging. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung transplanterter Zellen in lebenden Organismen.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

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