Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Willkommen im Labor von Dr. Hiku Alge Blink. Wir danken dem California Institute of Regenerative Medicine für die Finanzierung dieses Projekts. Die Markierung von Stammzellen mit einem fluoreszenten Kontrastmittel ermöglicht ein In-vivo-Tracking von transplantierten Stammzellen in vivo.

Die anschließende optische Bildgebung der markierten Stammzellen ermöglicht Längsschnittstudien, bei denen die Migration der Zellen in vivo nichtinvasiv überwacht werden kann. In diesem Video wird gezeigt, wie man sowohl humane embryonale Stammzellen als auch humane mesenchymale Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Hallo, ich bin Sophie Boddington von der Contrast Agent Research Group in der Abteilung für Radiologie an der University of California in San Francisco.

Heute möchte ich Ihnen zwei verschiedene Techniken zur Markierung von Stammzellen mit fluoreszierenden Kontrastmitteln vorstellen. Eine Methode zur Markierung von mesenchymalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff DID und eine weitere zur Markierung von humanen embryonalen Stammzellen mit Endign ingra. Lassen Sie mich damit beginnen, Ihnen unsere Technik zur Markierung humaner mesenchymaler Stammzellen mit DID zu zeigen.

Um das Verfahren zur Markierung mesenchymaler Stammzellen zu beginnen, müssen wir sie abtrennen und zählen, um eine Zellsuspension mit einer definierten Zellanzahl zu erhalten. Da dies eine Standard-Technik der Zellkultur ist, werden wir sie nicht im Detail zeigen. Wir möchten die Zellen, die wir markieren wollen, in einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter in kulturbedingtem Medium ohne Serum suspendieren.

Zunächst geben wir fünf Mikroliter des DID-Kontrastmittels pro Milliliter Zellsuspension hinzu. Anschließend mischen wir die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren, und die Zellen werden 20 Minuten lang in einer 6-Well-Platte mit niedriger Anhaftung bei 37 Grad Celsius mit der Markierungslösung inkubiert. Sobald die einfache Inkubation abgeschlossen ist, müssen wir die Zellsuspension nun in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.

Wir zentrifugieren es bei 400 RCF für fünf Minuten. Anschließend aspirations wir das Markiermedium unter der Bedingung, dass das Pellet nicht gestört wird. Nun waschen wir die Zellen mit PBS.

Wir pipettieren die Zellen mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass das Zellagglomerat aufgelöst wird. Die letzten beiden Schritte wiederholen wir noch zweimal, sodass wir insgesamt drei Waschschritte durchgeführt haben.

Nun zählen wir die Zellen und führen einen Trip- und Blautest durch, um die Zellviabilität zu bestimmen. Nach der Bestimmung der Zellviabilität sind Ihre Zellen bereit, im optischen Bildgebungssystem abgebildet zu werden. Um mit dem Verfahren zur Markierung menschlicher embryonaler Stammzellen zu beginnen, müssen wir zunächst das als Indocyaningrün bekannte Kontrastmittel vorbereiten.

Dann mischen wir es mit dem Transfektionsmittel, das als Protamin bekannt ist. Zunächst wiegen wir ein Milligramm des Indocyaningrün-Pulvers ab und lösen es in hundert Mikrolitern DMSO auf. Wir geben 400 Mikroliter DMEM, das 10 % FCS enthält, zu der Mischung hinzu und schütteln sie gründlich, sodass wir eine Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter Indocyaningrün erhalten.

Danach fügen wir das Transfektionsmittel Protamin hinzu, das als Shuttle für das Kontrastmittel wirkt und dessen effizienteren Eintritt in die Zelle ermöglicht. Nun mischen wir fünf Mikroliter Protaminsulfat mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter mit 300 Mikrolitern ICG und 300 Mikrolitern serumfreiem DMEM. Anschließend schütteln wir die neue Transfektionslösung fünf Minuten lang, um die Bildung von Komplexen zu ermöglichen.

Danach aspirationsieren wir das alte Medium und geben 10 Milliliter vorgewärmtes DMEM zu den Zellen. Wir fügen die zuvor hergestellte Protamin-ICG-Lösung zu den Zellen hinzu und beginnen die einstündige Inkubation, indem wir die Schale in den Inkubator bei 37 Grad Celsius stellen. Nach Abschluss der Inkubation nehmen wir die Schale aus dem Inkubator, aspirationsieren die Markierungslösung und waschen die Zellen, indem wir die Schale mit fünf Millilitern PBS spülen.

Die Zellen werden anschließend fünf Minuten bei 37 Grad Celsius mit Trypsin behandelt. Durch Schütteln der Schale lassen sich die Zellen leichter in Suspension lösen. Nun pipettieren wir vorsichtig mehrmals auf und ab, um die verbleibenden Kolonien aufzulösen.

Wir neutralisieren die Trypsinlösung, indem wir eine gleiche Menge DMEM mit 10 % FCS in die Schale geben. Anschließend überführen wir die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren die Lösung fünf Minuten bei 400 ×g. Wir resuspendieren die Zellen in vollständigem Kulturmedium.

Wir können nun verbleibende Zellklumpen oder Komplexe entfernen, indem wir die Zellen durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb leiten. Sobald wir eine klumpenfreie Zellsuspension erhalten haben, aspirations das alte Medium ab und resuspendieren das Pellet in vorerwärmtem vollständigem humanen embryonalen Stammzellmedium. An diesem Punkt müssen wir die murinen Fütterungszellen von den humanen embryonalen Stammzellen trennen.

Dies geschieht, um sicherzustellen, dass wir später nur die Stammzellen abbilden. Dazu überführen wir die Zellsuspension in eine mit Gelatine beschichtete 10 cm große Petrischale. Wir stellen die Schale in den 37 °C-Inkubator und lassen sie 45 Minuten lang stehen.

Während dieser Zeit darauf achten, die Schale nicht zu stören. Nun werden die Futterzellen an der Schale haften, die Stammzellen hingegen nicht. Wir überführen die Lösung aus der Petrischale heraus und erhalten nun eine markierte Einzelzelllösung menschlicher embryonaler Stammzellen.

Wir können nun die Zellen zählen und einen Trip-Test in Blau an ihnen durchführen. Nach Bestätigung der Vitalität sind unsere Zellen bereit, abgebildet zu werden. Die Abbildung zeigt ein Beispiel dafür, wie Stammzellen in vivo bei Mäusen sichtbar gemacht werden können, nachdem sie mit einem fluoreszierenden Kontrastmittel markiert und über eine i.p.-Injektion verabreicht wurden.

Die seriellen optischen Bildgebungsaufnahmen zeigten eine anfängliche Anreicherung der Zellen in den Lungen, gefolgt von einer Umverteilung in Leber, Knochenmark der Extremitäten und Schilddrüse. Die fluoreszierende Markierung kann auch zur direkten Darstellung transplantierten Stammzellen in histopathologischen Präparaten mittels Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Stammzellen mit fluoreszierenden Kontrastmitteln bei der Zellmarkierung markiert.

Es ist wichtig, daran zu denken, jeden Schritt zu standardisieren. Dies tun wir, um eine konsistente Markierungseffizienz und Zellviabilität sicherzustellen, sodass Ergebnisse aus verschiedenen Experimenten miteinander verglichen werden können. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei der Zellmarkierung.