Name: Etablierung eines Aufzuchtsystems für Chilithripse (Scirtothrips dorsalis Hood) zum Virulenzscreening von entomopathogenen Pilzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T15:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Erfahren Sie ein optimiertes Aufzuchtsystem für Chilithripse (Scirtothrips dorsalis) in Agar-Gefäßen zur effizienten Virulenzprüfung entomopathogener Pilze an zweiten Larvenstadien.

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<ol><li>Kumar, V., Kakkar, G., McKenzie, C. L., Seal, D. R., Osborne, L. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Weed+and+pest+control-conventional+and+new+challenges%22">Weed and pest control-conventional and new challenges</a>. , 53-77 (2013).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>#00 Insektennadel</td><td>Entosphinx&nbsp;</td><td>DMM0220</td><td>Hergestellt in Großbritannien</td></tr><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning integriert</td><td>MCT-175-C</td><td>Hergestellt in den USA</td></tr><tr><td>10 &mu; L Impföse</td><td>NEST Wissenschaftlich</td><td>718201</td><td>Hergestellt in den USA</td></tr><tr><td>100 bp DNA-Leiter III</td><td>Geneaid</td><td>DL007</td><td>Hergestellt in Taiwan.</td></tr><tr><td>2x SuperRed PCR Mastermix</td><td>Biowerkzeuge</td><td>TE-SR01</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>6 cm Petrischale</td><td>Alpha Plus Wissenschaftlich</td><td>16021</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioman Scientific</td><td>AGR001.1</td><td>Mikrobiologie-Klasse</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioman Scientific</td><td>PB1200</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>BioGreen Sicherer DNA-Gel-Puffer</td><td>Bioman Scientific</td><td>SDB001T</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>Easy DNA Hochgeschwindigkeits-Extraktions-Gewebe-Kit</td><td>Fisher Biotec</td><td>ET-100</td><td>https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (Hergestellt in Australien)</td></tr><tr><td>Grundierung vorne: LCO 1490</td><td>Genomik&nbsp;</td><td>PO-PR220919G6</td><td>Sequenz: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'</td></tr><tr><td>GenepHlow Gel/PCR Kit</td><td>Geneaid</td><td>DFH300</td><td>http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf</td></tr><tr><td>Aufzuchtbehälter aus Glas&nbsp;</td><td>Sunshine Lab Equipment Unternehmen</td><td></td><td>Größe: 35 mm Höhe, 45 mm Innendurchmesser. Kann durch jede ähnliche Größe von Kunststoff- oder Glasbechern ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Paul Marienfeld</td><td>640030</td><td>Hergestellt in Deutschland</td></tr><tr><td>Brutkasten</td><td>Hipunkt</td><td>Nr. F740</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>Leder-Cutter</td><td>Echte handgefertigte Werkstatt</td><td></td><td><ein href="https://shopee.tw/jj891004?categoryId=100636&amp; entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406">https://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406</a></td></tr><tr><td>MiniAmp Thermocycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. A37834</td><td>Hergestellt in den USA</td></tr><tr><td>optisches Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>&nbsp; Ci-L</td><td>Hergestellt in Japan</td></tr><tr><td>Malpinsel</td><td>Tian Cheng Bürstenfirma</td><td>4716608400352</td><td>Kann durch einen Aquarellpinsel mit feiner Spitze ersetzt werden, der einem Rundpinsel der Größe 0 oder 1 entspricht.</td></tr><tr><td>Küchenpapier</td><td>Mai-Blume</td><td>BLS007-8</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Hergestellt in den USA</td></tr><tr><td>Stößel für Pellets</td><td>Bioman Scientific</td><td>GT100R</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>Grundierung auf der Rückseite: HCO 2198</td><td>Genomik&nbsp;</td><td>PO-PR220919G6</td><td>Sequenz: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'</td></tr><tr><td>Sabouraud Dextrose-Brühe</td><td>HiMedia</td><td>MH033-500G</td><td>Hergestellt in Indien</td></tr><tr><td>stereomikroskop</td><td>Soptop</td><td>SZN71</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>TAE-Puffer 50X</td><td>Bioman Scientific</td><td>TAE501000</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>PanReac AppliChem</td><td>142050.1661</td><td>Hergestellt in Taiwan</td></tr><tr><td>Tasche mit Reißverschluss</td><td>Firma Wenchen Plastic</td><td>1809000061</td><td>Größe: 12 cm breit und 17 Zentimeter lang. (Hergestellt in Taiwan)</td></tr></tbody></table>

etablierung eines aufzuchtsystems für chilithripse (scirtothrips dorsalis hood) zum virulenzscreening von entomopathogenen pilzen

Establishment of a Chilli Thrips (Scirtothrips dorsalis Hood) Rearing System for Virulence Screening of Entomopathogenic Fungi

Das in dieser Studie vorgestellte experimentelle Flussdiagramm zeigte, dass das stabile Aufzuchtsystem der Chilithripse etabliert werden konnte, beginnend mit der Feldsammlung bis zum Screening der Virulenz von EPF-Isolaten (Abbildung 1). Obwohl die morphologische Beobachtung Chilithripse von anderen Blütenthripsen unterscheiden kann, kann die Verwendung der partiellen COI-Sequenz als molekularer Marker, einschließlich PCR-Amplikongröße und COI-Sequenzierung,...

Etablierung eines Aufzuchtsystems für Chilithripse (Scirtothrips dorsalis Hood) zum Virulenzscreening von entomopathogenen Pilzen

The chilli thrips (Scirtothrips dorsalis Hood) is an economically significant pest of ornamental and food crops in Taiwan. Entomopathogenic fungi (EPF) ...

Chilithripse sind ein gut untersuchter Schädling bei mehreren Kulturen. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Verbesserung des Zuchtsystems von Chilithripsen und die Erweiterung seiner Anwendungen auf entomopathogene Pilz-Screenings für zukünftige Experimente. Jüngste Studien haben sich auf die Massenaufzucht von Chilithripsen an ganzen Pflanzen in Käfigen konzentriert. Einige erforschen Alternativen wie abgelöste Blätter, aber die klaren und detaillierten Methoden sind noch nicht gut beschrieben.Diese Studie etablierte eine neue Methode zur Massenaufzucht von Thripsen, die auf abgelösten Blättern basiert und stabile Chilithripskolonien gewährleisten kann. Darüber hinaus wurde ein stabiles und reproduzierbares Bioassay-System für das Virulenzscreening von entomopathogenen Pilzen entwickelt. Dieses Protokoll behebt das Fehlen einer klaren standardisierten Methode zur Bekämpfung von Thripsen mit Blattscheibe und konzentriert sich auf die Verbesserung des Inspizientmanagements und die Reduzierung des Ressourcenverbrauchs.Dieses Protokoll vereinfacht die Kontrolle in der Entwicklungsphase, reduziert den Platz- und Arbeitsaufwand und bietet eine konsistente Thripsversorgung, die für groß angelegte und zuverlässige Bioassays geeignet ist. Unser Labor wird sich auf die Optimierung der Massenaufzuchtmethoden und die Anwendung dieses Protokolls auf verschiedene Thripsarten konzentrieren, um die Umwelt- und Handhabungsbedingungen zu verbessern, um konsistente und gesunde Populationen für Bioassays zu gewährleisten. Außerdem kann das Massenaufzuchtsystem erweitert werden, um Gewächshausversuche zu verwenden.Schneiden Sie zunächst Blätter und Blüten ab, die von Chilithripsen befallen sind. Füllen Sie sie in einen Plastikbeutel mit Reißverschluss und stellen Sie sicher, dass der Beutel mit etwas Luft verschlossen ist, um die Risse am Leben zu erhalten. Besorgen Sie sich als Nächstes einen Aufzuchtbehälter aus Glas mit einer Höhe von 35 Millimetern und einem Innendurchmesser von 45 Millimetern.Legen Sie drei Lagen kreisförmiges Papiertuch mit einem Durchmesser von jeweils 40 Millimetern auf den Boden des Behälters. Geben Sie 8 bis 10 Tropfen gefiltertes Wasser auf die Papiertücher, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Waschen Sie nun ein junges Mangoblatt gründlich.Untersuchen Sie es unter einem optischen Mikroskop, um es auf Insekteneier oder andere Insektenkontaminationen zu überprüfen. Schneiden Sie das Mangoblatt mit einem Lederschneider in eine kreisförmige Scheibe von 40 Millimetern Durchmesser und legen Sie sie auf das nasse Papiertuch im Glasaufzuchtbehälter. Beobachten Sie die Chili-Thripse unter einem optischen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung.Mit einem feinen Malpinsel 10 adulte Thripse, bestehend aus fünf Männchen und fünf Weibchen, in den vorbereiteten Aufzuchtbehälter aus Glas umfüllen. Verschließen Sie dann jeden Glasaufzuchtbehälter mit zwei Lagen Parafilm. Erzeugen Sie mit einem Insektenstift mit der Nummer 0-0 etwa 40 kleine Löcher in den Parafilm, um eine gute Belüftung zu gewährleisten.Stellen Sie den verschlossenen Aufzuchtbehälter aus Glas für 48 Stunden in einen Inkubator. Beobachten Sie das Blattgewebe unter einem Stereomikroskop, um das Vorhandensein von Eiern zu bestätigen, die die Position der Eizellen anzeigen. Legen Sie dann eine frische Mangoblattscheibe auf das Blatt mit den Eiern und geben Sie 8 bis 10 Tropfen gefiltertes Wasser auf das Papiertuch, um die Feuchtigkeit zu erhalten.Für die Pflege der Thripse das Blatt mit den ersten Larven des Stadiums direkt in einen neuen Aufzuchtbehälter aus Glas umfüllen. Beobachte die Chilithripse täglich. Für die Massenaufzucht der Chilithripse sammeln Sie zunächst weibliche adulte Thripse aus der erhaltenen Population.Setze 10 weibliche adulte Thripse in einen vorbereiteten Aufzuchtbehälter um, um Eier zu erhalten. Dann werden ca. 120 Larven des ersten Stadiums mit einem feinen Pinsel vorsichtig in ein neues Aufzuchtgefäß aus Glas umgefüllt. Für die molekulare Identifizierung sammeln Sie einen adulten Chilithrips in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Die Chilithripse mit einem Pelletstößel homogenisieren. Isolieren Sie dann die genomische DNA mit einem handelsüblichen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers und amplifizieren Sie sie mit dem PCR-Mastermix. Überprüfen Sie das PCR-Amplikon durch Elektrophorese in einem 1%Agarose-Gel, um das Ergebnis der Amplifikation zu überprüfen.Schneiden Sie die Zielbande mit einer Größe von etwa 658 Basenpaaren aus dem Gel heraus. Führen Sie eine Blast-Suche in der NCBI-Datenbank mit Standardparametern durch, um die Identität der Art zu bestätigen. Für die Herstellung von entomopathogenen Pilzen geben Sie zwei bis drei Milliliter 0,03 % Tween 80 auf die Oberfläche einer 10 bis 14 Tage alten Pilzkultur, die auf 1/4 Stärke Sabouraud-Dextrose-Agar gewachsen ist.Kratzen Sie die Konidien vorsichtig mit einer sterilen Schlaufe ab. Übertragen Sie die Pilzsuspension in ein sauberes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Homogenisieren Sie dann die Suspension, indem Sie sie bei maximaler Geschwindigkeit vortexen.Filtern Sie die Suspension durch Filterpapier, um Hyfil-Ablagerungen zu entfernen und eine reine Konidiensuspension zu erhalten. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Konidien unter einem Lichtmikroskop zu überprüfen. Verdünnen Sie die Suspension, um eine Konzentration von 10 hoch 8 Konidien pro Milliliter zu erreichen.Übertragen Sie dann die konidische Suspension in ein Mikrosprühgerät, das mit ultraviolettem Licht sterilisiert ist, um sie anschließend für den Bioassay zu verwenden. Sammeln und waschen Sie junge Heidelbeerblätter von einer Heidelbeerfarm. Untersuchen Sie nach dem Trocknen an der Luft ihre Oberfläche unter einem Stereomikroskop, um sie auf verbleibende Gliederfüßer oder Eier zu überprüfen und diese gegebenenfalls zu entfernen.Schneide nun mit einem Lederschneider eine Blattscheibe mit einem Durchmesser von 2,8 Zentimetern ab. Desinfizieren Sie dann die Blattscheibe in einer 1%igen Natriumhypochloritlösung. Und spülen Sie es dreimal zweimal mit sterilisiertem Wasser aus, um Bleichmittelrückstände zu entfernen.Gießen Sie als Nächstes drei Milliliter 2,5%igen Wasser-Agar in kleine Glasbehälter in einer Laminar-Flow-Haube. Übertragen Sie dann die Blattscheibe vorsichtig mit der adaxialen Seite nach oben auf den Agar und betten Sie sie leicht ein, so dass nur ein kleiner Teil über der Oberfläche freiliegt. Sobald der Agar vollständig erstarrt ist, sollten Sie die Glasbehälter für den Bioassay bereit halten.Vor dem Auftragen die Konidialsuspension gründlich vortexen. Tragen Sie mit einem Mikrosprühgerät 0,1 Milliliter der Suspension aus einem Abstand von etwa 10 Zentimetern im Inneren des Glasbehälters gleichmäßig auf die Oberfläche jeder Blattscheibe auf. Verwenden Sie nun einen feinen Pinsel, um 10 zweite Instar-Larven in jeden Glasbehälter zu übertragen.Verschließen Sie jeden Behälter mit zwei Schichten Parafilm. Erstellen Sie ca. 30 kleine Löcher für die Belüftung im Parafilm mit einem Insektenstift mit der Nummer 0-0. Stellen Sie die Behälter dann für sieben Tage in einen Inkubator.Beobachten und notieren Sie die Sterblichkeit von Chilithripsen sieben Tage lang täglich unter einem Stereomikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Bewahren Sie die toten Larven zur Mykosebeobachtung in dem Glasbehälter auf, um eine endopathogene Pilzinfektion zu bestätigen. Für den Bioassay ausgewählter entomopathogener Pilze sind drei Konzentrationen von Konidiensuspensionen herzustellen.Die Suspensionen in verschiedene Aufzuchtbehälter impfen. Transformieren Sie die Mortalitätsdaten jedes Pilzstamms mithilfe einer Arkussinustransformation vor der Durchführung einer unidirektionalen ANOVA, um signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen zu bestimmen. Berechnen Sie dann die Werte für die mediane letale Zeit und die mediane letale Konzentration mithilfe der Nachlassregressionsanalyse.Morphologische Merkmale von Chilithripsen in verschiedenen Lebensstadien wurden deutlich beobachtet, einschließlich des frühen Larvenstadiums, des späteren Larvenstadiums und des adulten Stadiums. Die Amplifikation der Polymerase-Kettenreaktion, die auf das partielle COI-Gen abzielte, erzeugte eine Bande, die die Identität der im Feld gesammelten Thripse als Chilithripse bestätigte. Das Aufzuchtsystem mit abgelösten Blättern unterstützte erfolgreich die Etablierung der Chilithripskolonie mit einer Überlebensrate von 90 %, die in der Kontrollgruppe über den siebentägigen Beobachtungszeitraum beobachtet wurde.Unter den getesteten entomopathogenen Pilzisolaten verursachte Cordyceps cateniannulata NCHU-213 sieben Tage nach der Inokulation die höchste Mortalität bei Chilithripslarven, gefolgt von Cordyceps cateniannulata NCHU-298, während Beauveria bassiana eine geringere Virulenz aufwies. Der LT50-Wert von 10 hoch 8 Konidien pro Milliliter Cordyceps cateniannulata NCHU-213 und Cordyceps cateniannulata NCHU-298 zeigte ähnliche Werte und kürzere Tage als Beauveria bassiana. Mykose wurde sichtbar an Thripsleichen beobachtet, die mit Cordyceps-Isolaten infiziert waren, wie man an den Pilzauswüchsen sehen konnte, die ihren Körper bedeckten.Ein dosisabhängiger Anstieg der Mortalität war bei Thripsen zu beobachten, die vier und fünf Tage nach der Inokulation mit Cordyceps cateniannulata NCHU-213 behandelt wurden, während die höchste Mortalität von 71,4 % bei 10 hoch 7 Konidien pro Milliliter nach sieben Tagen beobachtet wurde, gefolgt von 58,9 % bei 10 hoch 8 Konidien pro Milliliter und 44,4 % bei 10 hoch 6 Konidien pro Milliliter.

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Etablierung eines Aufzuchtsystems für Chilithripse (Scirtothrips dorsalis Hood) zum Virulenzscreening von entomopathogenen Pilzen (Video) | JoVE Journal

Etablierung eines Aufzuchtsystems für Chilithripse (Scirtothrips dorsalis Hood) zum Virulenzscreening von entomopathogenen Pilzen

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