Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie zur hochauflösenden Kartierung der Mikrogefäße des Nagetiergehirns

Unsere Forschung zielt darauf ab, die mikrovaskuläre Architektur und den Fluss des Gehirns zu charakterisieren und gleichzeitig Superauflösungs-Ultraschallmethoden zu verfeinern. Jüngste Entwicklungen haben die Mikroblasenverfolgung optimiert und die Verarbeitungspipelines gestärkt, um stabilere Protokolle für superauflösende Gefäßkartierung mit ULM zu schaffen. Zu Beginn setzen Sie eine betäubte Maus auf einen stereotaxischen Rahmen mit einem Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.

Mit festem, aber nicht schädlichem Druck kneifen Sie die Zehe oder den Schwanz, um das Fehlen von Reflexen zu überprüfen und die ausreichende Anästhesietiefe zu überprüfen. Tragen Sie auf beide Augen eine Augensalbe auf, um während des Eingriffs Augenschwüre und Kataraktbildung zu verhindern. Rasiere jetzt den Kopf der Maus mit einem Trimmer.

Enthaarungscreme auftragen. Lassen Sie es maximal ein bis 1,5 Minuten einwirken, spülen Sie es dann gründlich mit warmem Wasser ab und trocknen Sie es mit Mullbinde. Anschließend wird das Zentrifugal-Ultraschallgel auf den Kopf aufgetragen, um eine akustische Kopplung sicherzustellen.

Für die Katheterisation der Schwanzvenen verwenden Sie ein 27-Zoll-Halbzoll-Flügelinfusionsset, das mit einer 18-Zoll-Halbzoll-Nadel mit acht Zoll Schlauch verbunden ist. Kürze das Rohr, wenn möglich, um das Totvolumen zu minimieren. Drehen Sie den Schwanz des Tieres vorsichtig um 90 Grad, um die seitlichen Schwanzvenen freizulegen.

Dann befestigen Sie den Schwanz mit Klebeband, um die Stabilität zu erhalten und eine Bewegung während der Katheterisation zu verhindern. Identifizieren Sie jetzt die Schwanzvene. Um die Sichtbarkeit der Venen zu verbessern, wärmen Sie den Schwanz mit lauwarmem Wasser, um die Vasodilatation zu fördern.

Mit einem Finger üben Sie sanften Druck an der Basis des Schwanzes aus und schieben Sie ihn gegen die Durchblutungsrichtung zur Injektionsstelle. Führe die Nadel parallel zur Vene ein, wobei der Fasen nach oben zeigt. Beobachten Sie den Schlauch auf Blutflashbacks, um die korrekte Nadelposition zu bestätigen.

Auf dem Bildgebungssystem starten Sie die funktionale Ultraschallaufnahme-Software und erstellen Sie eine neue Experimentsitzung. Stellen Sie die Position der Ultraschallsonde ein. Starten Sie nun die Live-View-Aufnahme in der Software und passen Sie die Sonde in Echtzeit mit Power-Doppler-Bildgebung an, um das Gehirn auf dem Bildschirm zu zentrieren.

Optimieren Sie die Bildparameter wie Kontrast und Kompression, um die Visualisierungsqualität zu verbessern. Dann öffne das Angio-3D-Menü in der Erfassungssoftware. Passen Sie die Scan-Parameter so an, dass das Gehirn vollständig abgedeckt wird, und beginnen Sie dann mit der Aufnahme des Scans.

Halten Sie die Akquisitionssoftware offen, und sobald das Angio 3D fertig ist, starten Sie die IcoStudio-Software für Analyse und Visualisierung. Lade den Angio-3D-Scan zur Prüfung. Navigiere zum Gehirnregistrierungspanel und registriere den Angio-3D-Scan entweder im vollautomatischen oder manuellen Modus.

Speichere die abgeschlossene Registrierung als BPS-Datei. Öffne jetzt das Brain-Navigationsmenü und scrolle nach unten zum Atlas-Manager-Panel. Verwenden Sie den Navigator für Eltern- und Unterstammbaum, um den Allen-Mouse-Gehirnatlas zu durchsuchen, und wählen Sie die gewünschten anatomischen Bereiche für die Überlagerung im Drei-Ansichten-Panel aus.

Wählen Sie eine Bildebene, die sich mit den ausgewählten Interessensbereichen überlappt. In der koronalen Ansicht werden zwei Marker manuell platziert, um den gewünschten Bildschnitt zu definieren. Klicken Sie dann auf BPS Positioning, um die Motorkoordinaten für die ausgewählte Bildfläche zu extrahieren.

Sehen Sie sich die Bildvorschau aus dem Angio-3D-Scan an und klicken Sie auf BPS-Koordinaten kopieren. Wechsle zur IcoScan-Software und öffne das Move-Probe-Panel. Klicken Sie auf Neuronavigation, fügen Sie die kopierten Werte ein und lassen Sie das System die Sonde automatisch mit der ausgewählten Bildfläche ausrichten.

Dann starten Sie mit Live-Aufnahmen, um sicherzustellen, dass die aktuelle Bildfläche mit der zuvor ausgewählten Ebene ausgerichtet ist. Mit einer sterilen Spritze werden fünf Milliliter 0,9 % Natriumchloridlösung in das Ultraschallkontrastmittel-Mikroblasenfläschchen durch das Septum injiziert. Rühren Sie das Fläschchen energisch 20 Sekunden lang, um die Mikroblasen wieder aufzuhängen und eine gleichmäßige Dispersion sicherzustellen.

Definieren Sie die Aufnahmeparameter vor, einschließlich Ultraschallsequenz, Bildrate und Gesamtaufnahmedauer. Dann zieht man das gewünschte Volumen an Mikroblasen für die Injektion ab und beginnt mit der Aufnahme. Sobald die Aufnahme beginnt, werden 100 Mikroliter für Mäuse mit der entsprechenden Verdünnung injiziert.

Kontrastverstärkung im Live-Visualisierungspanel bestätigen. Spülen Sie die verbleibenden Mikroblasen im toten Volumen sofort durch Injektion von physiologischer Flüssigkeit in den Katheter. Warte, bis die Erfassung abgeschlossen ist, und speichere die aufgezeichneten Daten.

Öffnen Sie die Icolab-Software und klicken Sie auf den Tab Ultraschalllokalisierungsmikroskopie. Klicken Sie dann auf Compute ULM maps, um den Verarbeitungsprozess zu starten. Wählen Sie den Quellordner aus, der die zuvor erfassten Daten enthält.

Wählen Sie dann die jeweilige Scandatei aus und passen die Bearbeitungszeitgrenzen bei Bedarf an. Klicken Sie auf Next, um zum Berichtsschritt zu wechseln. Stellen Sie den Ausgabeordnerpfad zum Speichern der verarbeiteten Dateien ein und konfigurieren Sie die Visualisierungsparameter für die Berichtsbilder.

Klicken Sie nun auf Ausführen, um mit der Datenverarbeitung zu beginnen. Nach Abschluss wird eine TRK-Datei erstellt, die lokalisierte Mikroblasenkoordinaten enthält, zusammen mit TIFF-Dateien, die Dichte, Geschwindigkeit und rückgestreute Amplitude darstellen. Laden Sie die TRK-Datei in IcoStudio, um mit der Erkundung der verarbeiteten Daten zu beginnen.

Dann verwenden Sie das rechte Seitenpanel in IcoStudio, um Visualisierungsparameter wie Kontrast, Kompression und Farbkarte für eine verbesserte Datendarstellung anzupassen. Um die Integrationszeit festzulegen, passen Sie den Doppelschieber am unteren Rand der Hauptansicht an, um die Start- und Endbilder für die Analyse zu definieren. Der Dichte-Tab zeigt die Verteilung der Mikroblasenvorkommen.

Wählen Sie zwischen absoluter Dichte und gerichteter Dichte. Danach klicken Sie auf den Reiter Velocity, um die Mikroblasengeschwindigkeit in Millimetern pro Sekunde mit absoluten, Richtungs-, Axial- und Lateralmodi anzuzeigen. Passen Sie die Kontrast-, Kompressions- und Geschwindigkeitsschwellenwerte an, um die Bildklarheit zu verbessern.

Dann erkunden Sie den Tab Backscattered Amplitude, um die Mikroblasenreflexion zu sehen, die den Kontrast erhöht und mikrovaskuläre Strukturen sowie Bewegungen außerhalb der Ebene offenbart. Exportiere Bilder als hochauflösende PNGs oder generiere TIFF-Dateien für quantitative Analyse mit anpassbarer Pixelgröße. Mikroblasendichtekarten eines koronalen Ratten-Gehirnschnitts, der mit ULM aufgenommen wurde, trennten sowohl große Gefäße als auch feine Kapillarstrukturen und zeigten detaillierte Gefäßtopologie, einschließlich Bifurkationen und Verzweigungsmustern.

Die Geschwindigkeitskarte desselben Hirnschnitts zeigte einen klaren axialen Richtungsfluss, wobei der Aufwärtsfluss den venösen Abfluss und der Abwärtsfluss der arteriellen Perfusion entspricht, was mit der bekannten kortikalen Gefäßarchitektur übereinstimmt. Die rückstreute Amplitudenkarte bot tiefenabhängigen Kontrast und markierte Schiffe basierend auf ihrer Höhenposition, was nützlich ist, um Schiffe außerhalb der Ebene oder mit niedriger Amplitude zu segmentieren. Gefäßdichtekarten, die in derselben Maus eine schwache Trennung erfahnten, zeigten starke räumliche Überlappungen, was die Reproduzierbarkeit der koronalen Ebenen-Zielerfassung mittels des Gehirnpositionierungssystems bestätigte.

Eine quantitative Analyse des linken somatosensorischen Kortex über Sitzungen hinweg zeigte ähnliche Verteilungen in Gefäßradius, Geschwindigkeit und Durchflussrate und zeigte die Reproduzierbarkeit der Messe. Eine ähnliche Reproduzierbarkeit wurde im linken Thalamusbereich beobachtet, mit konsistenten Werten für Gefäßradius, Geschwindigkeit und Durchflussrate zwischen Woche eins und Woche zwei. Diese Arbeit zeigt, dass Ultraschalllokalisationsmikroskopie zuverlässig superauflösende Karten der mikrovaskulären Struktur und des Flusses in vivo erzeugen kann.

Dieses Protokoll erfüllt den Bedarf an einem standardisierten Verfahren, das robuste ULM-Aufnahmen bei lebenden Nagetieren mittels eines speziellen funktionellen Ultraschallsystems ermöglicht.