Translational relevantes Tumorresektionsmodell für murine präklinische Modelle des oralen Plattenepithelkarzinoms

Diese Arbeit konzentriert sich auf die Untersuchung von Mundkrebs und etabliert ein praxisnahes präklinisches Modell für orthotope Tumorresektion und -rückfall. Die Operation ist eine primäre Behandlungsmethode für die Mehrheit der Patienten mit Mundkrebs. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, das zu untersuchen.

Zu Beginn sollten Sie eine Kulturflasche mit 80 % konfluenten Mach-2-Mundkrebszellen aufnehmen. Entferne das Kulturmedium aus dem Kolben. Waschen Sie die angeschlossenen Zellen mit Magnesium und calciumfreiem PBS, um das verbleibende Serum zu entfernen.

Fügen Sie ein ausreichendes Volumen hinzu, um die Oberfläche des Gefäßes mit den Zellen vollständig zu bedecken, und aspirieren Sie dann. Gib 0,05 % Trypsin in den Kulturkolben, um die Unterseite ausreichend zu bedecken. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für etwa 5 Minuten, um eine Zellablösung zu ermöglichen.

Wenn eine Zellablösung festgestellt wird, wird das Trypsin durch das Hinzufügen von mindestens dem Doppelten des Volumens des vollständigen Mediums abgeschreckt. Sanft mischen, um die enzymatische Aktivität zu stoppen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie bei 350 G für 5 Minuten bei Raumtemperatur.

Entsorge das Überlagerungsmittel nach der Zentrifugation. Das Zellpellet in kaltem PBS wieder suspendieren. Entfernen Sie ein Aliquot der Suspendierung für die Zellzählung.

Mit zusätzlichem PBS stellen Sie die Zellsuspension auf die optimierte Konzentration für die Impfung ein. Lassen Sie die vorbereitete Zellsuspension auf Eis, bis sie einsatzbereit ist. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten.

Sammeln Sie die Suspension in eine 0,3-Milliliter-Insulinspritze. Halte die narkose Maus mit einer Hand vom hinteren Hals aus, sodass die vordere Seite zum Handler zeigt und der Kopf nach oben geneigt ist. Halten Sie den Mund in einer offenen und zugänglichen Position.

Führen Sie die Spritze vorsichtig in den offenen Mund in einem abwärts gerichteten Winkel zum linken unteren Untermandibularvestibül ein. Führe die Nadel durch die untere buckale Schleimhaut. Geben Sie 30 Mikroliter der Zellsuspension in den Zielbereich.

Halte die Spritze 5 Sekunden lang an Ort und Stelle und ziehe sie dann langsam zurück, um eine Zellverfolgung zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Maus nach der Impfung wieder in einen normalen körperlichen und verhaltensbezogenen Zustand zurückkehrt. Während sich die Tumore entwickeln, überwachen Sie das Gewicht der betäubten Maus mittels einer Waage und bewerten Sie das Tumorwachstum zweimal pro Woche mit digitalen Bremssatteln.

Wählen Sie einen sauberen Behandlungsraum mit einer schließbaren Tür und begrenztem Verkehr. Stelle einen neuen Käfig mit sauberer, trockener Einstreu und einem Papiertuchnest teilweise auf einen elektrischen Wärmer, um ihn vorzuwärmen. Erwärmen Sie einen Perlensterilisator auf eine Betriebstemperatur von 250–265 Grad Celsius.

Schalten Sie ein wasserbeheiztes OP-Pad ein und stellen Sie die Temperatur auf etwa 39 Grad Celsius ein. Tragen Sie eine kleine Menge Haarentfernungscreme auf die Tumorresektionsstelle bei einer betäubten Maus mit einem Baumwollspitzenapplikator auf. Sorgen Sie für ausreichende Ränder, damit Haare aus dem Schnittbereich fernbleiben.

Nach 10 Sekunden das Haar mit trockenem, sauberem Mull abwischen. Entfernen Sie eventuelle Restcreme mit Mullbinden oder mit Wasser befeuchteten Wattestäbchen. Legen Sie die betäubte Maus auf das Heizkissen in Rückenlage, wobei die vordere Seite nach oben zeigt.

Positioniere die Nase direkt innerhalb des Nasenkegels. Tragen Sie nun auf jedes Auge eine ausreichende Menge steriles Gleitmittel auf, um während des Eingriffs nicht auszutrocknen. Mit einem sauberen Applikator für Baumwollspitzen wird die Resektionsstelle mit 70 % Isopropylalkohol gefolgt von 10 % Jod abgestrichen und die Sequenz dreimal wiederholt.

Entferne das Jod nach dem letzten Durchgang mit 70 % Isopropylalkohol. Tragen Sie sterile Handschuhe und geeignete persönliche Schutzausrüstung und bereiten Sie ein steriles Feld von mindestens 18 Zoll Breite und 26 Zoll Länge vor. Legt alle benötigten sterilen Werkzeuge und Materialien bereit.

Bedecke die Maus mit einem sterilen Vorhang. Schneiden Sie mit einer sterilen Schere ein Zugangsloch über der Resektionsstelle. Mit einem neuen chirurgischen Skalpell wird ein submandibulärer Schnitt direkt unterhalb des Tumors entlang der linken Kieferlinie erzeugt.

Mit Hartmann-Hämostaten werden die Schnittöffnungen zum Tumor hin vorsichtig erweitert. Tupfen Sie das Blut bei Bedarf mit sterilem Gaze. Lokalisieren Sie den Tumor und halten Sie ihn mit einer Pinzette fest.

Ein Assistent in steriler PSA kann die Maus oder ihre Haut während dieses Eingriffs an Ort und Stelle halten. Mit einer chirurgischen Schere schneiden Sie um die Basis des Tumors herum, um sämtliches sichtbares Gewebe zu entfernen. Positionieren Sie die Haut über der entfernten Tumorstelle und schließen Sie dann den Schnitt mit 4–6 unterbrochenen Nähten mit 4/0 langanhaltenden Vicryl-Nähten.

Nach dem Schließen des Schnitts wird die Maus vorsichtig in den vorgewärmten Käfig übertragen und bis zur vollständigen Genesung auf Bewusstsein und Beweglichkeit überwacht. Geben Sie sofort weiche Lebensmittel, indem Sie mit Wasser eingeseifte Pellets in einen zugänglichen Behälter im Käfig legen. Wenn keine Komplikationen auftreten, nehmen Sie bei der nächsten routinemäßigen Fütterung wieder die normale feste Ernährung der Maus fort.

Mit Hilfe der Mach-Two-Zelllinie wurden Tumoren in der Maus-Mundschleimhaut etabliert und daraus entfernt. Die Tumorwachstumskinetik wurde vor der Resektion charakterisiert. Nach der Tumorresektion wurde in den Tagen unmittelbar nach der Operation eine Verzögerung des Tumorwachstums beobachtet, was sich an einer verkleinerten Tumorfläche kurz nach der Resektion im Vergleich zu unresezierten Tumoren zeigt.

Eine geringfügige Verlängerung der Gesamtüberlebensrate wurde in der resektierten Gruppe im Vergleich zur nicht resezierten Kontrollgruppe beobachtet, obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war. Die Mäuse in der unresezierten Gruppe erreichten die Euthanasiekriterien erstmals am 12. Tag nach der Operation, während die Mäuse in der resektierten Gruppe erst am 19. Tag die Euthanasiekriterien erfüllten. Der wichtigste Aspekt bei der Anwendung dieses Protokolls ist die Konsistenz bei der Tumorinokulation und -Transplantation.

Über dieses Verfahren hinaus können wir die entfernten Tumore zur Analyse mittels Durchflusszytometrie oder Immunhistochemie untersuchen. Zukünftige Studien können auf dieser Arbeit aufbauen, indem sie sie mit zusätzlichen Behandlungen kombinieren. Sie können sich auch mit der Untersuchung der Tumor-Immunmikroumgebung im Zusammenhang mit der Resektion und dem Wiederauftreten beschäftigen.