Optimierte minimal-invasive transsklerale subretinale Injektionstechnik in der Maus

Subretinale Injektionen sind ein wichtiges Instrument für die präklinische Abklärung von Therapien für erbliche Netzhauterkrankungen. In diesem Video stellen wir eine optimierte, minimal-invasive subretinale Injektionstechnik bei Mäusen vor. Transsklerale subretinale Injektionen sind eine hervorragende Möglichkeit, Material an Photorezeptoren und RPE zu liefern.

Diese Technik ist jedoch technisch anspruchsvoll und erfordert die Entwicklung eines optimierten Protokolls, um die Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit zu erhöhen. Zu unseren Verbesserungen gehören die Entwicklung eines Maus-Augenlidspekulums, die präoperative Verabreichung von Atropin, die Erstellung einer punktgenauen Sklerotomie mit einem Diamantmesser und die Optimierung der Nadelgröße und des Injektionsansatzes. Wir hoffen, dass die Konsistenz, Reproduzierbarkeit, die hervorragende Transduktionsabdeckung und die minimalen chirurgischen Schäden unserer Methode die Zugänglichkeit subretinaler Injektionen für die wissenschaftliche Gemeinschaft verbessern werden.

Unsere Optimierungen machen es einfacher und schneller, subretinale Injektionen bei Mäusen durchzuführen, die experimentelle Variabilität zu reduzieren und die Erfolgsraten bei der Injektion zu verbessern. Diese Technik wird die zukünftige präklinische translationale Netzhautforschung erleichtern. Zu Beginn verabreichen Sie ein Milligramm pro Kilogramm Atropin intraperitoneal in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern 30 Minuten vor der Durchführung der subretinalen Injektion.

Beladen Sie eine Mikronadel aus Glas mit dem gewünschten Volumen der Injektionslösung. Befestigen Sie die Nadel am Mikroinjektor und stellen Sie den Ausgleichsdruck auf fünf Hektopascal ein, um der Kapillarwirkung entgegenzuwirken. Legen Sie die anästhesierte Maus unter ein Präparierstereomikroskop.

Tragen Sie einen Tropfen 0,5% Proparacain auf das Auge auf, um eine topische Anästhesie zu erreichen. Tragen Sie einen Tropfen einer Mischung mit 0,2 % Cyclopentolat und 1 % Phenylephrin auf das Auge auf, um die Pupille für die postoperative Darstellung der subretinalen Blase zu erweitern und intraoperative Blutungen zu reduzieren. Legen Sie mit einem speziellen Miniatur-Drahtspekulum das überlegene Fornix frei und immobilisieren Sie das Spekulum, um ein freihändiges Zurückziehen des Oberlids zu ermöglichen.

Machen Sie mit einer abgewinkelten Vannas-Schere etwa einen Millimeter hinter dem Limbus in der oberen Bindehaut und der Tenon-Kapsel einen limbalen Schnitt, um die obere Sklera freizulegen. Entfernen Sie vorsichtig alle Reste der Tenon-Kapsel über der Injektionsstelle. Fassen Sie nun den vorderen Rand der Bindehautperitomie und -tenotomie mit einer verriegelnden Zahnzange.

Ziehen Sie dann die Kugel vorsichtig induktual, um die Sklera superior freizulegen. Tragen Sie sofort einen Tropfen ausgewogene gepufferte Kochsalzlösung auf das Auge auf, um die nackte Sklera mit Feuchtigkeit zu versorgen und eine größere optische Vergrößerung zu erzielen. Führen Sie mit einem Diamantmesser eine punktgenaue Sklerotomie bei etwa 12 Uhr und ein bis zwei Millimeter vom Limbus entfernt durch.

Positionieren Sie die Klinge tangential zur Sklera, um sicherzustellen, dass die Sklerotomie klein und flach ist. Verwenden Sie einen chirurgischen Schwamm, um die balancierte gepufferte Kochsalzlösung vorsichtig von der Augenoberfläche zu entfernen. Halten Sie die Nadelabschrägung in einem flachen Winkel zur Sklera und führen Sie die Spitze langsam in die Sklelotomie ein, wobei Sie nur 0,5 bis einen Millimeter vorrücken, um Zugang zum subretinalen Raum zu erhalten, ohne in die Netzhaut einzudringen.

Halten Sie die Nadel ruhig, initiieren Sie die Injektion bei 500 Hektopascal mit dem Fußpedal und halten Sie den Druck 15 Sekunden lang konstant. Entfernen Sie die Nadel und beobachten Sie einen teilweisen Rückfluss der injizierten Lösung durch die Sklerotomiestelle, was auf eine erfolgreiche Verabreichung hinweist, da der subretinale Raum nicht das volle Volumen der injizierten Lösung aufnehmen kann. Entfernen Sie vorsichtig die Verriegelungszange und das Lidspekulum, ohne Druck auf den Globus auszuüben, um zusätzlichen Reflux zu vermeiden.

Tragen Sie unmittelbar nach der Injektion eine großzügige Menge Gleitaugensalbe auf das Auge auf, um die subretinale Blasensichtbarmachung zu unterstützen. Eine subretinale Blase war in der OCT unmittelbar nach der transskleralen Injektion deutlich sichtbar, was die erfolgreiche Entbindung bestätigte. Zur Bewertung des retinalen Pigmentepithels (RPE) wurde Dystrophin 1-GFP injiziert, was zu einer weit verbreiteten grünen Fluoreszenz über die Epithelschicht führte, was auf eine effiziente und breite RPE-Transduktion unter Verwendung des transskleralen Ansatzes hinweist.

AAV-8-Rhodopsin GFP führte zu einem starken grün fluoreszierenden Signal in Stäbchen-Photorezeptoren, das sowohl in Querschnitten als auch in Fundusansichten sichtbar war, was auf ein erfolgreiches Targeting und eine erfolgreiche Expression in Photorezeptorzellen hinweist. AAV8-CAG-mCherry erzeugte eine breite rote Fluoreszenz über die Netzhautschichten hinweg, was die Fähigkeit dieser Technik zeigt, die generalisierte Transgenexpression über spezifische Zelltypen hinaus zu unterstützen. Das Western-Blotting von retinalen Lysaten zeigte ebenfalls eine starke Expression von grün fluoreszierenden Proteinen, wobei die höchsten Konzentrationen dem Zentrum der Injektionsblase entsprachen, was die Photorezeptortransduktion mit AAV8-Rhodopsin-GFP bestätigte.

Die AAV-Titeroptimierung mittels Immunfluoreszenzanalyse von Netzhautschnitten ermöglicht die Auswahl des Virustiters, der die Transduktion von etwa 90% der Zielzellen erreicht. Zum Beispiel führte in diesem Fall eine Verdünnung von eins bis 10 eines AAV8-Rhodopsin-GFP-Virusstamms zu einer Transgenexpression in fast allen Photorezeptoren. Im Gegensatz dazu führte eine Verdünnung von eins zu 100 zu einer unzureichenden Transduktionsrate.

Das Elektroretinogramm zeigte, dass transsklerale Injektionen die normale Netzhautfunktion bewahrten, während transretinale Injektionen zu signifikant reduzierten A-Wellen- und B-Wellen-Reaktionen führten, was auf eine Netzhautschädigung hinweist.