Erforschung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen: Fortschritte in der Kernspinresonanz

Wir untersuchen Protein-Protein- und Protein-Glykan-Wechselwirkungen, wobei wir uns auf den Integrin-Disintegrin-Komplex konzentrieren. Unser Modell untersucht die Strukturdynamik und hebt die Rolle der Oberflächenkraft bei der Vermittlung komplexer Bildung und Wechselwirkungsstabilität hervor. Unsere Gruppe widmet sich der Untersuchung der Rolle von Oberflächenkräften bei der molekularen Erkennung und Evolution von Bindungsstellen durch die Untersuchung von hydrophoben Oberflächenclustern, die in Proteinen vorhanden sind.

Die NMR-Lösung ermöglicht den Nachweis von Proteininteraktionen. Obwohl schwache Wechselwirkungen für das Leben unerlässlich sind, gibt es eine Tendenz zu hochaffinen Komplexen, obwohl sie in vielen wichtigen biologischen Funktionen vorhanden sind. Unsere Gruppe konzentriert sich auf die Verwendung integrativer strukturbiologischer Ansätze, um große Proteinkomplexe zu untersuchen.

Wir verwenden die NMR als Hauptwerkzeug, um dynamische und funktionelle Aspekte zu untersuchen. Bereiten Sie zunächst eine vier Millimolare Lösung von D-Mannose in Natriumphosphatpuffer bei pH 7,4 mit 50 Millimolar Natriumchlorid und 5% Deuteriumoxid vor. Teilen Sie die Lösung in zwei Proben auf, eine mit 80 mikromolaren CVN und die zweite ohne.

Um die Ligandenbindung durch chemische Verschiebungsstörung auf dem NMR-Spektrometer abzubilden, richten Sie die HSQCTOPSI-Pulssequenz für die H1C13-HSQC-Erfassung ein. Konfigurieren Sie den Zeitbereich, die spektrale Breite, die Trägerfrequenz und die Anzahl der Scans. Berechnen Sie die Störung der chemischen Verschiebung mit der bereitgestellten Gleichung.

Um die Ligandenbindung durch die Sättigungstransferdifferenz abzubilden, erstellen Sie zunächst einen neuen Datensatz. Konfigurieren Sie die Parameter für STD-NMR-Experimente, indem Sie entweder verschiedene Sättigungsfrequenzen screenen oder die Frequenz festlegen, während Sie die Sättigungszeiten variieren, um den Aufbau zu bewerten. Richten Sie 1D-H1-NMR-Experimente mit der ZGPR-Pulssequenz ein.

Stimmen Sie das Spektrometer auf H1 ab, führen Sie Shimming durch und messen Sie einen harten 90-Grad-Puls. Zentrieren Sie die Trägerfrequenz bei etwa 4,7 ppm, entsprechend dem Wassersignal, und wählen Sie dann STDDIFFESGP aus. 3 Impulssequenz und stellen Sie die Erfassungsparameter ein.

Stellen Sie die spektrale Breite nach Bedarf ein, unterbrechen Sie die Scanverzögerung D1 auf vier Sekunden und definieren Sie die Sättigungszeit D20 gemäß den Versuchszielen. Laden Sie die FQ2-Liste mit einer Off-Resonanzfrequenz von minus 40 Teilen pro Million und On-Resonance-Frequenzen, um nur das Protein zu sättigen. Testen Sie die On-Resonanz-Frequenzen von minus 0,59, 0,73 und 8,1 ppm, um optimale Bedingungen zu bestimmen.

Verwenden Sie die optimale Frequenz, um STD-Spektren bei Sättigungszeiten von 0,5, eins, 1,5, zwei, 2,5, drei und vier Sekunden zu erfassen. Plotten Sie die entsprechenden ASTD-Werte als Funktion der Sättigungszeit. Stellen Sie nun die Anzahl der Scans auf 64 ein und mitteln Sie die Experimentschleife viermal.

Berechnen Sie dann die Gesamtzahl der Scans. Stellen Sie die Interscan-Verzögerung auf vier Sekunden und die Erfassungszeit auf 2,7262976 Sekunden ein. Konfigurieren Sie den Sättigungsimpuls durch Einstellen der Dauer auf 50 Millisekunden und Steuern der Gaußschen Form über das Formprogramm 9SP9.

Wenden Sie einen T1-Zeilenfilter in der STD-NMR-Variante an und stellen Sie dann die Spin-Lock-Zeit D29 basierend auf der Proteingröße ein. Um die Ligandenbindung H1 R2 zu kartieren, wählen Sie zunächst das CPMG_ESGP2D Pulsprogramm aus der Bruker-Standardbibliothek aus. Legen Sie das Experiment als 2D-Erfassung fest.

Konfigurieren Sie die Erfassungsparameter wie gezeigt. Führen Sie dann das Experiment für 200 Zyklen mit jeweils acht Scans durch. Passen Sie die Liste der variablen Zähler entsprechend der gewünschten Gesamtzeit des CPMG-Zyklus an.

Führen Sie zwei Experimente durch, eines für die Probe mit dem Protein und eines für die reine Ligandenprobe. Plotten Sie die H1-Spektren für jedes TCPMG mit dem Befehl EFP oder Sinus M gefolgt von FP und passen Sie dann die Fensterfunktion entsprechend der besten Verarbeitungsstrategie an. Berechnen Sie den CPMG-Quotienten Q anhand der Gleichung.

Erfassen Sie H1N15HSQC Spektren von N15-markiertem CVN bei 298 Kelvin. Titrieren Sie mit D-Mannose, um die Endkonzentrationen von null, eins, zwei, fünf, 10, 20, 40 und 60 Millimol zu erreichen. Verwenden Sie phasenempfindliche FHSQCF3GPPH schnelle HSQC-Pulssequenzen aus der Bruker-Standardbibliothek.

Berechnen Sie dann die Störung der chemischen Verschiebung mit der Formel. Plotten Sie die CSP-Werte für jeden Rest als Funktion der D-Mannose-Konzentration, um die Dissoziationskonstante KD unter Verwendung von Gleichung fünf zu bestimmen. Passen Sie dann die resultierenden Daten mithilfe der Formel an eine einzelne Bindungsisotherme an.

Verwenden Sie eine phasenempfindliche HSQCT2ETF3GPSI3D Pulssequenz und konfigurieren Sie die Parameter wie gezeigt, um die N15 R2-Werte der einzelnen Reste von CVN-Resten in Abwesenheit und Anwesenheit von 60 millimolaren D-Mannose bei 298 Kelvin zu messen. Verarbeiten Sie pseudo-dreidimensionale Spektren mit NMRPipe, um HSQC-ähnliche Spektren für jede Relaxationsverzögerung zu erzeugen. Importieren Sie die verarbeiteten Spektren in eine Analyseplattform.

Wählen Sie dann alle Spektren aus und wenden Sie das Werkzeug "Intensitätsänderungen verfolgen" an. Plotten Sie die Intensität jedes Cross-Peaks als Funktion der T-Relaxation und passen Sie den Zerfall an eine monoexponentielle Funktion an, um N15 R2-Werte für jeden Rest zu extrahieren. Berechnen Sie den experimentellen Fehler aus dem Signal-Rausch-Verhältnis der HSQC-ähnlichen Spektren bei 67,84 Millisekunden.

Verarbeiten Sie einen Bereich des Spektrums, der nur Rauschen enthält, und konvertieren Sie ihn mit dem angegebenen Befehl in eine Textdatei. Bestimmen Sie dann die Standardabweichung des Lärmbereichs oder der Geräuschintensität mit Hilfe einer Statistiksoftware. Berechnen Sie den experimentellen Fehler mit der angegebenen Gleichung.

Chemische Verschiebungsstörungen wurden für beide anomeren Formen von D-Mannose in Gegenwart von CVN beobachtet, wobei größere Verschiebungen bei beta-D-Mannose beobachtet wurden, was auf eine bevorzugte Bindung hinweist. Für die meisten D-Mannose-Wasserstoffatome in Gegenwart von CVN wurden zwei unterschiedliche Peaks beobachtet, die dem freien und gebundenen Zustand entsprechen. Die Wasserstoffkerne mit den höchsten ASTD-Werten waren mit beta-D-Mannose assoziiert, was mit starken bipolaren Wechselwirkungen mit CVN übereinstimmt.

In der transversalen Relaxationsratenanalyse war H beta vier das einzige Proton, das eine bemerkenswerte Zunahme der Relaxation bei Bindung an CVN zeigte. Die durch die Zugabe eines Liganden induzierten chemischen Verschiebungsstörungen von H1 und N15 waren bei Konzentrationen bis zu 10 Millimolaren am höchsten. Die Reste I40, E41, N42, V43, D44 und G45 innerhalb des Beta-Strangs zeigten signifikante chemische Verschiebungsstörungen, was sie als hochaffine Bindungsstelle für D-Mannose identifizierte.

Bindungsisothermen zeigten, dass der Rest D44 mit einer Dissoziationskonstante von etwa einem Millimolar die höchste Affinität unter den Beta-Strangresten aufwies. Die Messung der N15 R2-Relaxationsraten zeigte sowohl einen Anstieg als auch eine Abnahme der Delta-R2-Werte bei der D-Mannose-Bindung, was auf eine Mischung aus Konformationsstabilisierung und Austauschprozessen hindeutet. Die Reste C58, R59, K74 und R76 zeigten erhöhte Delta-R2-Werte, was ihre Beteiligung an der hochaffinen Bindungsstelle bestätigt, während die Reste F4, C8, R24 und G27 die niedrigaffine Region repräsentierten.