Maus-mesenteriale Lymphadenektomie zur selektiven Störung der lymphatischen Kommunikation mit dem regionsspezifischen Darm

Unsere Forschung konzentriert sich auf T-Zell-Reaktionen auf Neoantigene und periphere Gewebe, und diese Reaktionen werden stark vom Priming beeinflusst, weshalb wir uns hauptsächlich darauf konzentrieren, wo diese Priming-Ereignisse stattfinden. Derzeit sind die einzigen weit verbreiteten Optionen zur Blockierung des Transports zwischen Lymphknoten und Geweben systemische Modalitäten wie S1P-Rezeptoragonisten und die Integrinblockade. Diese breite Hemmung hindert uns jedoch daran, den Beitrag bestimmter lokaler Lymphknoten zu untersuchen.

Unser Protokoll bietet eine ausführliche Beschreibung hochselektiver Lymphadenektomien an jeder der vier wichtigsten mesenterischen Lymphknotenstationen, und da diese Lymphknoten auf das Darmsegment spezialisiert sind, das sie entwässern, ermöglicht uns dieses gut verträgliche Überlebensverfahren, bestimmte Segmente der Darmlymphachse zu stören, während der Rest intakt bleibt. Nach Bestätigung der angemessenen Anästhesietiefe mittels eines Hinterfußkneifens wird mit steriler chirurgischer Schere ein 0,5 bis 1 Zentimeter großer Hautschnitt in der Mittellinie der betäubten Maus gemacht. Mit steriler Zange wird die Haut von der Bauchwand entfernt und die Linea alba identifiziert.

Dann machen Sie einen weiteren Schnitt von 0,5 bis 1 Zentimeter durch die Linea alba, um Zugang zur Peritonealhöhle zu erhalten. Mit einer stumpfen Gavage-Nadel wird ein Milliliter steriler Kochsalzlösung bei Körpertemperatur in die Peritonealhöhle eingefügt. Befeuchten Sie die sterilen Vorhänge, um die Darmposition vorzubereiten.

Um die erste Lymphknotenstation zu entfernen, orientieren Sie den äußeren Darm auf feuchte Vorhänge, wobei das Dekum nach unten positioniert ist, der proximale Dickdarm oben und das terminale Ileum zum Chirurgen hin. Identifizieren Sie die mesenterische Lymphknotenkette, die längs entlang des Dickdarms verläuft. Mit schräg, feinspitzen Pinzetten sezieren Sie die erste Lymphknotenstation stumpf von den ileokolischen Gefäßen weg, indem Sie die geschlossenen Pinzetten zwischen diese Strukturen legen und sie vorsichtig öffnen.

Um das theoretische Risiko eines Kollateralflusses zu benachbarten Knoten zu verringern, führen Sie eine optionale Nahtligation mit einzelnen unterbrochenen Nähten entlang der Lymphknotenkette durch, einen Millimeter distal und einen Millimeter proximal zur ersten Lymphknotenstation, mit Monofilament-Nylonnaht und einer feinspitzen Pinzette. Ziehe die Lymphknotenstation vorsichtig caudal zurück und entferne dann mit einer feinen Schere die Ziel-Lymphknotenstation von der Kopf- in die Kaudalrichtung. Beobachten Sie die distalen Äste der ileokolischen Gefäße, Ilealgefäße und Jejunalgefäße, um sicherzustellen, dass die Blutversorgung intakt bleibt.

Um die zweite Lymphknotenstation zu entfernen, wird der Dünndarm vorsichtig ausgeweidet und der äußere Darm auf feuchte Vorhänge ausgerichtet, wobei das Dekum nach unten positioniert ist, der proximale Dickdarm oben und der Dünndarm zur rechten Seite des Chirurgen. Identifizieren Sie anschließend die zweite Lymphknotenstation, die längs entlang des Dickdarms verläuft und an der Mündung von Ileal- und Jejunalgefäßen beginnt. Mit einer schräg, feinspitzen Pinzette seziert man die zweite Lymphknotenstation stumpf von den Darmgefäßen entfernt.

Um das theoretische Risiko eines Kollateralflusses zu benachbarten Knoten zu verringern, führen Sie eine optionale Nahtbindung mit einzelnen unterbrochenen Nähten entlang der Lymphknotenkette durch, einen Millimeter distal und einen Millimeter proximal zur zweiten Lymphknotenstation, mittels Monofilament-Nylonnaht und einer feinen Pinzette. Ziehe die Lymphknotenstation vorsichtig kaudal zurück und entferne dann mit einer feinen Schere die zweite Lymphknotenstation von der Kopf- in die Schwanzrichtung. Inspiziere das Operationsfeld, um eine Hämostase sicherzustellen.

Um die vierte Lymphknotenstation zu entfernen, wird der gesamte Dünndarm vorsichtig bis zum hinteren Befestigungspunkt ausgeweidet. Orientieren Sie den Darm auf feuchte Vorhänge mit dem Dekum nach unten, dem proximalen Dickdarm oben und dem Dünndarm zur rechten Seite des Chirurgen. Identifizieren Sie die vierte Lymphknotenstation, die sich direkt medial des distalen Dickdarms und lateral zur dritten Station befindet.

Mit schräg, feinspitzen Zangen oder einer besonders feinen Schere wird die vierte Lymphknotenstation stumpf von den Darmgefäßen und dem umliegenden Fettgewebe entfernt spart. Um das theoretische Risiko eines Kollateralflusses zu benachbarten Knoten zu verringern, führen Sie eine optionale Nahtbindung mit einzelnen unterbrochenen Nähten an jedem identifizierbaren Lymphknoten durch, meist einen Millimeter vom Knoten entfernt, mit Monofilament-Nylonnaht und einer feinen Pinzette. Dann ziehe die vierte Lymphknotenstation Cephalad vorsichtig zurück.

Mit einer feinen oder extra-feinen Schere schneiden Sie die Lymphknotenstationen von der Kaudal- bis zur Cephalad-Station. Wiederholen Sie das Verfahren für den zweiten Knoten an der vierten Lymphknotenstation. Sezieren Sie den Knoten sorgfältig, führen Sie bei Bedarf eine Nahtligierung durch und entfernen Sie ihn.

Inspizieren Sie das Operationsfeld, um die Hämostase zu bestätigen. Nachdem der Bauchinhalt in die Bauchhöhle zurückgeführt wurde, gib einen Milliliter steriler Kochsalzlösung bei Körpertemperatur in die Bauchhöhle, um den Verdunstungsflüssigkeitsverlust auszugleichen. Schließen Sie den Bauch in zwei Schichten: zuerst die Bauchwand, dann die Haut mit einer 6-0-Monofilament-Polypropylennaht in einem laufenden Muster.

Gewebeextraktion, das mit der mesenterischen Lymphadenektomie gewonnen wurde, führte konsequent zu Proben mit niedrigem Fettgehalt, wie das sofortige Absinken im PBS zeigte. Die Durchflusszytometrieanalyse bestätigte eine erfolgreiche Lymphknotenextraktion, wobei über 95 % der Zellen in mesenteria, lymphadenektomischen Proben als CD45-positiv identifiziert wurden, verglichen mit nur 7 % bei viszeralen Fettgewebekontrollen.