Name: Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Lernen Sie die I-GONAD-Methode zur vereinfachten Erzeugung von Knockout-Mäusen durch In-Utero-Elektroporation. Diese Technik reduziert den Tierverbrauch und erreicht Effizienzen vergleichbar mit Mikroinjektion.

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<ol><li>Fujihara, Y., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Based+Genome+Editing+in+Mice+by+Single+Plasmid+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection.</a> Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+complete+gene+knockout+mice+and+monkeys+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+with+multiple+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs.</a> Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+i-GONAD+suitable+for+production+of+genome-edited+C57BL%2F6+inbred+mouse+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain.</a> Cells. 9 (4), 957(2020).</li>
<li>Takabayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+i-GONAD+in+mice+at+early+zygote+stage+through+in+vivo+electroporation+three+minutes+after+intra-oviductal+instillation+of+CRISPR-ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein.</a> Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+i-GONAD%3A+An+improved+in+vivo+technique+for+CRISPR%2FCas9-based+genetic+manipulations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice.</a> Cells. 9 (3), 546(2020).</li>
<li>Kessler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+super-enhancer+region+establishes+inter-TAD+interactions+and+controls+Hoxa+function+in+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest.</a> Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).</li>
<li>Kaneko, T., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+genome+editing+by+electroporation+using+embryos+artificially+removed+cumulus+cells+in+the+oviducts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts.</a> Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((i-GONAD%3A+A+robust+method+for+in+situ+germline+genome+engineering+using+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases.</a> Genome Biol. 19 (1), 25(2018).</li>
<li>Marshall, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PerlPrimer%3A+Cross-platform%2C+graphical+primer+design+for+standard%2C+bisulphite+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR.</a> Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+Tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT).</a> BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Brinkman, E. K., Van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+evaluation+of+CRISPR+genome+editing+by+TIDE+and+TIDER%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Gene+Editing%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER.</a> CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).</li>
<li>Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+wild+strains+of+mice+using+the+i-GONAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method.</a> Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).</li>
<li>Iwata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+large-scale+chromosomal+engineering+of+mouse+zygotes+viain+vitro+and+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation.</a> Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).</li>
<li>Abe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+large-fragment+knock-in+animal+production+without+ex+vivo+handling+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes.</a> Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).</li>
<li>Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+cortical+electroporation+of+plasmids+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5 & Strich; 5 μL-Pipette&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>4642020</td><td></td></tr><tr><td>1,5-mL-Röhre</td><td>Aptaca</td><td>1003/G</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 uL Pipette&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>200-uL-Röhre</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>20-200 μL Pipette&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>2-20 μL Pipette &nbsp;</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>4x Gel-Ladefarbe</td><td>Biolabmix</td><td>D-3002</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>AppliChem</td><td>A8963,0500</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-frei (1 U/&mu; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 100 mM Lösung</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA-Polymerase (5 U/&mu; L)</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EditCo ICE-Analyse</td><td>https://ice.editco.bio/#/</td><td></td><td>Zugriff am 04.06.2025</td></tr><tr><td>EDTA 0,5M-Lösung, pH = 8</td><td>AppliChem</td><td>A4892.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>&nbsp; https://www.ensembl.org/index.html</td><td></td><td>Zugriff am 09.06.2025</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Biolabmix</td><td>EtBr-10</td><td></td></tr><tr><td>Augengel-Tropfen " Oftagel"</td><td>URSAPHARM</td><td>204604</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Dokumentationssystem ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>In-Silico PCR V39x1&nbsp;</td><td>https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr</td><td></td><td>&nbsp; Zugriff am 09.06.2025</td></tr><tr><td>Integrierte DNA-Technologien;</td><td>https://eu.idtdna.com</td><td></td><td>Zugriff am 09.06.2025</td></tr><tr><td>Mikrochirurgische Schere</td><td>Medin URAL</td><td>M124</td><td></td></tr><tr><td>NEPA21-Elektroporator</td><td>Nepa-Gen</td><td>NEPA21</td><td>Mit CUY652P2,5x4-Elektrode</td></tr><tr><td>NTP-Set, 100 mM-Lösung</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotide</td><td>Evrogen</td><td></td><td>Direkter Auftrag, Standardreinigung mit Entsalzung</td></tr><tr><td>Opti-MEM I reduziertes Serummedium</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PerlPrimer</td><td>https://perlprimer.sourceforge.net</td><td></td><td>Version 1.1.21.</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase (2 U/&mu; L)</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>F530L</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 10 μL</td><td>Ulplast</td><td>HT-10-960</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 1000 uL</td><td>Ulplast</td><td>HT-1000-576</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten-200-uL-Spitzen</td><td>Ulplast</td><td>HT-200-960</td><td></td></tr><tr><td>Stromversorgung " Elf-4"</td><td>DNA-Technologie</td><td>PS-400 NEU</td><td></td></tr><tr><td>RNAse/DNAse freies Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>PanEco</td><td>P011n</td><td></td></tr><tr><td>SE-1 horisontales Elektrophoresesystem</td><td>Helicon</td><td>SE-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Stufe 100 DNA-Leiter</td><td>Biolabmix</td><td>S-8100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop-SMZ1000</td><td>Nikon</td><td>5-363376</td><td></td></tr><tr><td>-Mikropipetter</td><td>CooperSurgical</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>-Spitzen</td><td>ORIGIO</td><td>MXL3-125</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Nadel&nbsp;</td><td>KMIZ</td><td>4A1- 0,6&-mal; 20</td><td></td></tr><tr><td>Nähzange</td><td>Medin URAL</td><td>M302.2</td><td></td></tr><tr><td>Nähzange</td><td>Medin URAL</td><td>M303</td><td></td></tr><tr><td>Nahtgewinde POLYCON N<img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/68704/68704eq1.jpg" style="Margin: auto; "/>0</td><td>Tonzos 95</td><td>234</td><td></td></tr><tr><td>SYNTHEGO Knockout-Leitfaden Design&nbsp;</td><td>https://design.synthego.com/#/</td><td></td><td>Zugriff am 09.06.2025</td></tr><tr><td>T100-Verstärker</td><td>BioRad</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>T7-RNA-Polymerase&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>TBE 10x Puffer</td><td>Biolabmix</td><td>TBE-500</td><td></td></tr><tr><td>Tide&nbsp;</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td>Zugriff am 04.06.2025 &NBSP;</td></tr><tr><td>Trishydrochlorid</td><td>Suzhou Yacoo Wissenschaft</td><td>SYS-S0005-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-Hydrochloridlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2663</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein</td><td>Invitrogen</td><td>A36499</td><td></td></tr><tr><td>Universalschere</td><td>Medin URAL</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Interchemie Werken de Adelaar</td><td>IX2</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac-Labor</td><td>2000443714739.00</td><td></td></tr></tbody></table>

verbesserte genom-editierung durch die verabreichung von eiduktalen nukleinsäuren in-vivo-elektroporationstechnik für die erzeugung von knockout-mäusen

Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery-based In Vivo Electroporation Technique for Knockout Mice Generation

Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen

Methods for creating knockout mice typically involve three main steps: (1) collecting embryos from donor females, (2) microinjecting genetic constructs ...

improved-genome-editing-via-oviductal-nucleic-acids-delivery-based

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Um die Funktion und die Regulation von Genen während der Entwicklung der dopaminergen Neurone im Mittelhirn zu bewerten, beschreiben wir eine Methode, die...

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Designer-Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) kann verwendet werden, um das Genom der Maus Präimplantationsembryonen durch Auslösen sowohl die nicht-homologe Ende (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) Wege ändern. Diese Fortschritte ermöglichen die schnelle Generierung von Mäusen, die mit präzisen genetischen Veränderungen.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Mikroinjektion von CRISPR-Cas9 und Spender-DNA durch Zygoten, um effizient Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Mäuse zu produzieren.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Dieses Protokoll beschreibt die Mikroinjektion und In-vivo-Elektroporation für die regional eingeschränkte CRISPR-vermittelte Genom-Editierung im Eileiter der Maus.

Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation

Dieses Protokoll stellt einen optimierten Ansatz zur Herstellung genetisch veränderter Rattenmodelle dar. Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird verwendet, um eine DNA-Reparaturvorlage zu liefern, und die Elektroporation wird verwendet, um CRISPR-Cas9-Reagenzien zu verabreichen, um den Genom-Editierungsprozess im 2-Zell-Embryo abzuschließen.

CRISPR-Cas9 Genom-Editierung von Rattenembryonen mit Hilfe des Adeno-assoziierten Virus (AAV) und der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen

Die Abgabe von Genomeditoren als RNAs ist ein besonders wirkungsvolles Mittel zur Modifikation der Genome primärer Säugetierzellen und -zelllinien. Ziel dieses Protokolls ist es, Genom-Editoren als mRNA in primäre Säugetierzellen und -zelllinien zu liefern, gefolgt von gezielter Illumina-Sequenzierung und Analyse zur Quantifizierung der Editierergebnisse.

Genom-Editierung in primären Säugetierzellen mittels Elektroporation von Editor-RNA

Lernen Sie die I-GONAD-Methode zur vereinfachten Erzeugung von Knockout-Mäusen durch In-Utero-Elektroporation. Diese Technik reduziert den Tierverbrauch und erreicht Effizienzen vergleichbar mit Mikroinjektion.

Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen (Video) | JoVE Journal

Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen

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