Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen

Ziel unserer Forschung ist es, die Erzeugung von Knockout-Mäusen zu vereinfachen, indem eine In-Utero-Elektroporation verwendet wird, bei der Genom-Editierungskomponenten direkt in die Eileiter schwangerer Weibchen eingetragen werden. Mikroinjektionen in Zygoten erfordern die Pflege einer großen Anzahl von Tieren, darunter Spender- und Empfängerweibchen sowie vasektomierte Männchen. Daher sind Protokolle, die die Nutzung von Tieren minimieren, vorzuziehen.

Der Einsatz des Nepa21-Systems zur Zygotenelektroporation bietet eine einzigartige Chance, gezielte Gen-Knockout-Mäuse in einem einzigen Schritt zu erzeugen, mit einer Effizienz, die mit Standard-Nuklearinjektionstechniken vergleichbar ist. Zunächst nutzen Sie computergestützte Analysetools, um potenzielle Single-Guide-RNA-Sequenzen zu identifizieren, die auf das ausgewählte Gen abzielen. Wählen Sie Sequenzen aus, die in Exonen liegen und so nah wie möglich an der gewünschten Mutationsstelle sind. Verwenden Sie einen Genombrowser, um die Exomstruktur abzugleichen und priorisieren Sie Sequenzen, die in den meisten Splice-Isoformen vorhanden sind.

Analysieren Sie die vorhergesagte Off-Target-Aktivität jeder Führungssequenz mithilfe des integrierten Bewertungssystems des Tools. Wählen Sie Sequenzen, die die geringste Wahrscheinlichkeit einer Off-Target-Bindung zeigen. Um eine lineare doppelsträngige DNA-Vorlage herzustellen, bereiten Sie die PCR-Mastermischung mit den in der gegebenen Tabelle angegebenen Komponenten vor.

Gib zuletzt die Polymerase hinzu und lasse die Hauptmischung auf Eis, um die enzymatische Stabilität zu erhalten. Führen Sie dann die PCR unter den folgenden thermischen Zyklenbedingungen durch. Als Nächstes bereitet man die in-vitro-Transkriptions-Mastermischung mit den gegebenen Komponenten vor und inkubiert die Reaktion 1,5 Stunden bei 37 Grad Celsius mit einem Thermocycler für eine gleichmäßige Temperaturkontrolle.

Dann geben Sie der Reaktion zwei Mikroliter DNase I hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für weitere 30 Minuten, um die DNA-Schablone zu verdauen, und inaktivieren Sie das Enzym dann bei 75 Grad Celsius für fünf Minuten. Nach der TRIzol-Reinigung der RNA wird die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer gemessen und die A260-zu-A280- sowie A260-zu-A230-Verhältnisse überprüft.

Um den Ribonukleoproteinkomplex für die Transfektion vorzubereiten, verdünnen Sie einen molaren Tris-HCl-Puffer mit nukleasefreiem Wasser auf eine Konzentration von 100 millimolaren. Filtern Sie die Lösung mit einem Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,022 Mikrometern. Aliquot in 10-Mikroliter-Portionen aufbewahren und bis zur Anwendung bei vier Grad Celsius lagern.

Als Nächstes wird die Transfektionsmischung mit spCas9-Nuklease, einer einzelnen Führungs-RNA und Tris-HCl hergestellt, die mit DEPC-Wasser in einem nukleasefreien Röhrchen verdünnt wurden. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Bildung des Ribonukleoproteinkomplexes zu ermöglichen. Dann wird die Transfektionsmischung in kleine Mengen versetzt, die für einzelne I-GONAD-Sitzungen geeignet sind, und bei vier Grad Celsius gehalten, um die Reagenzaktivität zu erhalten.

Nach der Paarung von CD1-Weibchen mit einhäutigen CD1-Männchen über Nacht sollte jedes Weibchen auf einen Kopulationsplug überprüft werden. Nur die Weibchen mit sichtbaren Plugs werden für weitere experimentelle Verfahren in einen neuen Käfig übertragen. Autoklaven alle chirurgischen Instrumente aus Edelstahl, um die Sterilität vor der Anwendung sicherzustellen.

Dann wiegt man die ausgewählten Plug=positive weiblichen Mäuse mit einer elektronischen Waage, bevor man sie betäubt. Überwachen Sie die anästhesierten Mäuse auf den Verlust des Zehenkneifreflexes, um eine ausreichende Anästhesie zu bestätigen. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur während des Eingriffs aufrechtzuerhalten.

Anschließend tragen Sie veterinärmedizinische Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit vorzubeugen. Mit einer feinen Schere machen Sie einen 0,7 Zentimeter langen Längsschnitt in der Haut des unteren Rückens. Dann werden die leicht geöffneten Spitzen der Schere seitlich gespreizt, um den Hautschnitt sanft auf etwa 1,3 Zentimeter zu verlängern.

Anschließend machen Sie vorsichtig einen 0,7 Zentimeter langen Schnitt im Bauchflatt, um die Bauchhöhle freizulegen. Verlängern Sie den Peritonealschnitt auf 1,1 Zentimeter und schieben Sie beidseitig mit leicht geöffneten Scherenspitzen. Finden Sie das Fettpad, das mit dem Eierstock verbunden ist, und ziehen Sie es vorsichtig mit der Pinzette nach außen, bis Eierstock, Eileiter und Gebärmutter freiliegen.

Mit einer Gefäßklemme sichern Sie das Fettpad, um die Fortpflanzungsstrukturen zu stabilisieren. Als Nächstes werden zwei Mikroliter der Ribonukleoprotein-Injektionsmischung mit einem-Pipetter in eine einwegwegige Kunststoffkapillare geladen. Mit einer Mikroschere machen Sie einen 0,2 Zentimeter großen Schnitt in die Wand des Eileiters einige Millimeter flussaufwärts der Ampulle.

Führen Sie die Kunststoffkapillare, die am-Pipetter befestigt sind, in den Eierleiterschnitt ein und stoßen Sie die Injektionsmischung vorsichtig aus, ohne Luft einzuführen. Ziehen Sie vorsichtig die plastische Kapillare aus dem Eileiter, um die Injektion abzuschließen. Schalten Sie den Elektroporator ein, indem Sie den Netzschalter an der Frontplatte drücken.

Stellen Sie die Elektroporationsparameter auf dem Gerät so ein, wie sie auf dem Bildschirm angezeigt sind. Mit Pinzettelektroden greifen Sie vorsichtig den Eileiter und drücken Sie den Kiloohm-Knopf, um den Widerstand zu messen. Unmittelbar nach der Widerstandsmessung drücken Sie den Startknopf, um mit der Elektroporation zu beginnen, und warten Sie, bis das Endsignal auf der Ohm-Taste erscheint.

Nach der Elektroporation des ersten Eileiters wird der Fortpflanzungstrakt vorsichtig in die Bauchhöhle zurückgeführt. Schließen Sie den Schnitt mit einer 4-0 Polyglykolsäure-Operationsnaht. Für die Genotypisierung entwerfen Sie 18 bis 21 Nukleotid-Primer mit einer Schmelztemperatur von etwa 60 Grad Celsius, um ein PCR-Produkt mit 300 bis 600 Basenpaaren zu erzeugen.

Um die Spezifität jedes Primers zu bestätigen, führen Sie eine BLAST-Suche in der Mausgenomdatenbank durch, um das Risiko einer unspezifischen Amplifikation zu eliminieren. Als Nächstes entnehmen Sie für die DNA-Extraktion mit einem Ohrpunch eine kleine Gewebeprobe von etwa zwei Millimetern Größe aus dem Ohr der Maus. Fügen Sie 100 Mikroliter Lysis-Puffer hinzu.

Inkubieren Sie die Probe bei 95 Grad Celsius für 60 Minuten und lassen Sie sie alle 20 Minuten vortexen, um eine effiziente Lyse zu gewährleisten. Nach der Durchführung der Sanger-Sequenzierung analysieren Sie die Ergebnisse, um die Ergebnisse der Genom-Editierung zu bewerten. Um die ICE-Analyse zu verwenden, laden Sie beide Sanger-Sequenzierungsdateien hoch, geben Sie die Guide-RNA-Sequenz ein und wählen Sie die passende Nuklease aus, die im CRISPR-Experiment verwendet wird.

Als Nächstes, um TIDE zu verwenden, laden Sie die Kontroll- und experimentellen Sequenzierungsdateien im AB1-Format hoch und geben Sie die Guide-RNA-Sequenz ein. Die ICE-Analyse entdeckte drei verschiedene Indel-Varianten an der Cas9-Schnittstelle: eine Ein-Basen-Entfernung in 42 % der Sequenzen, eine Drei-Basen-Paar-Deletion in 25 % der Sequenzen und eine 23-Basenpaar-Deletion in 27 % der Sequenzen. Der Modellanpassungswert lag bei 0,94 und der Knockout-Wert bei 69, was auf eine starke vorhergesagte Korrelation und wahrscheinlichen Gen-Knockout hinweist.

Sequenzchromatogramme bestätigten eine Störung an der Cas9-Schnittstelle in der bearbeiteten Probe, während das Kontrollchromatogramm eine intakte Sequenz an derselben Stelle zeigte. Von sechs elektroporierten Mäusen produzierten nur vier Jungtiere mit Mutationen, was zu einer Gesamtbearbeitungseffizienz von 60 % führte. Alle Würfe der sechs elektroporierten Mäuse zeigten eine geringere Welpenzahl, mit nur drei bis vier Jungen pro Maus.