Name: Verbesserung der Technologie für chimäre Antigenrezeptor-extrazelluläre Vesikel (CAR-EV): Die Zukunft der Krebstherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung von CAR-EVs für die Krebstherapie mittels Ionenaustauschchromatographie und Nanopartikel-Tracking-Analyse. Diese Methode ermöglicht die gezielte Abgabe therapeutischer Wirkstoffe an Tumorzellen.

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<ol><li>Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+CAR+T-cell+therapeutics+for+hematologic+malignancies%3A+Interpreting+clinical+outcomes+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date.</a> Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).</li>
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<li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+separation+and+purification+of+exosomes+using+ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Large-scale separation and purification of exosomes using ion-exchange chromatography.</a> Biomed Res Ther. 11 (4), 6348-6356 (2024).</li>
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<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-EGFR+ScFv+functionalized+exosomes+delivering+LPCAT1+specific+siRNAs+for+inhibition+of+lung+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22JNB%22%5BJournal%5D)">Anti-EGFR ScFv functionalized exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases.</a> JNB. 22 (1), 159(2024).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td><stark>Materialien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>Anreicherung von Elektrofahrzeugen</td></tr><tr><td>1 % Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771-100G</td><td>1 g SDS-Pulver in 10 mL Reinstwasser auflösen</td></tr><tr><td>1x Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST)</td><td>Thermo Scientific Chemikalien</td><td>Nr. J77500. K2</td><td>Mit Reinstwasser verdünnen, um eine 1x-Lösung herzustellen (alternativ eine 0,1%ige Polysorbat-20/Tween-20-Lösung in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung herstellen)</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte aus Polystyrol mit klarem Flachboden, TC-behandelt, steril</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>In vitro funktioneller Assay</td></tr><tr><td>Bolt Bis-Tris Plus Mini Protein Gele, 4-12%, 1,0 mm, WedgeWell-Format</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Charakterisierung von Zellen/EVs</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. A9647-100G</td><td>Charakterisierung von Zellen/EVs</td></tr><tr><td>Calnexin-Antikörper</td><td>Zelluläre Signalübertragung</td><td>2433S</td><td>Charakterisierung von Zellen/EVs</td></tr><tr><td>CAR-NK/T-Zellen</td><td>ProMab Biotechnologien</td><td>Variiert</td><td>Die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne von CAR hängt vom bevorzugten Ziel auf den Empfängerzellen ab</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Zellproliferations-Assay (MTS)</td><td>Promega</td><td>Nr. G3580</td><td>In vitro funktioneller Assay</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Zelllyse</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Detektionsreagenz</td><td>Amersham</td><td>RPN2232</td><td>Charakterisierung von Zellen/EVs</td></tr><tr><td>Elutions-Puffer</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV-Anreicherung/Isolierung</td></tr><tr><td>Äquilibrierungspuffer</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV-Anreicherung/Isolierung</td></tr><tr><td>EXO-ACE IEX-Säule</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV-Anreicherung/Isolierung für nachgelagerte Funktionsassays Patent-ID AU2024901931</td></tr><tr><td>EXO-NET Pan-Exosomen-Capture-Kügelchen</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV-Isolierung für die nachgelagerte Charakterisierung Patent-ID WO/2014/011673</td></tr><tr><td>Granzyme B Antikörper</td><td>Zelluläre Signalübertragung</td><td>4275</td><td>Charakterisierung von Zellen/EVs</td></tr><tr><td>Humanes IL-2 IS, Premium-Qualität</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td>Xenofreie Kultur von T/NK-Zellen</td></tr><tr><td>iBlot 2 Transferstacks, PVDF</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Charakterisierung von Zellen/EVs</td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF (cGMP)</td><td>Stammzellen-Technologien</td><td>100-0956</td><td>Xenofreie Kultur von T/NK-Zellen</td></tr><tr><td>K-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>In vitro funktioneller Assay</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>In vitro funktioneller Assay</td></tr><tr><td>Millex-GP Spritzenvorsatz-Filtereinheit, 0,22 & Mikro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td>Terminale Filtration</td></tr><tr><td>Puffer für die Regeneration</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV-Anreicherung/Isolierung</td></tr><tr><td>RIPA-Puffer (10-fach)</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>9806</td><td>Zelllyse</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Beurteilung der Zellviabilität und -dichte</td></tr><tr><td>Puffer waschen</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV-Anreicherung/Isolierung</td></tr><tr><td><stark>Ausrüstung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler</td><td>Invitrogen</td><td>Gräfin II FL</td><td>Beurteilung der Zellviabilität und -dichte</td></tr><tr><td>Automatisiertes Tisch-Extraktionsgerät</td><td>Invitrogen</td><td>KingFisher Apex-System</td><td>Automatisiertes Aufreinigungssystem mit hohem Durchsatz Weitere Informationen zum Protokoll finden Sie unter dem Link: https://www.inoviq.com/site/technology/resources</td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer 7</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)</td><td>Particle Metrix GmbH</td><td>Zetaview PMX-130</td><td>Partikel-Analyse</td></tr><tr><td>Teller-Lesegerät</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTROstar Nano</td><td>In vitro funktioneller Assay</td></tr><tr><td>Gekühlte Tischzentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-15R</td><td>Zellkultur & Verarbeitung der EV-Anreicherung</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Mini-Gel-Tank</td><td>Invitrogen</td><td>Nr. A25977</td><td>Charakterisierung von Zellen/EVs</td></tr><tr><td>Western-Blot-Transfersystem</td><td>Invitrogen</td><td>iBlot 2</td><td>Charakterisierung von Zellen/EVs</td></tr></tbody></table>

verbesserung der technologie für chimäre antigenrezeptor-extrazelluläre vesikel (car-ev): die zukunft der krebstherapie

Enhancing Chimeric Antigen Receptor-Extracellular Vesicles (CAR-EV) Technology: The Future of Cancer Therapy

Ein typischer Arbeitsablauf der CAR-T/NK-Zellkultivierung, gefolgt von der EV-Isolierung, Charakterisierung und Verwendung von EVs in einem funktionellen Assay, ist in Abbildung 1 dargestellt. CM aus der Kultivierung von CAR-T/NK-Zellen wird vor der EV-Anreicherung und der nachgelagerten Charakterisierung (einschließlich Nanopartikel-Tracking-Analyse) gesammelt und die funktionelle Aktivität mit einem Multi-Well-Platten-MTS-Assay bewertet (Abbildung 1).
GFP-markierte CAR-Zellen können mittels Mikroskopie sichtbar gemacht werden, um die Expression des CAR-Konstrukts in Kultur zu bestätigen. Die Mikroskopie sollte als Routineschritt vor und während der Entnahme des CM durchgeführt werden, um eine ausreichende Transduktionseffizienz zu gewährleisten. Es ist wichtig, Hellfeld- und GFP-Kanäle zu überlagern, um potenzielle Autofluoreszenz bei der Bewertung des Wirkungsgrads zu erfassen. Bemerkenswert ist, dass T-Zellen eine Tendenz zur natürlichen Verklumpung besitzen (ähnlich beobachtet bei NK-Zellen; Daten nicht gezeigt), und Fluoreszenz kann deutlich beobachtet werden, wenn Zellen einen verklumpten Phänotyp aufweisen (Abbildung 2).
Nach der EV-Anreicherung können EVs mittels NTA und westlichem Immunblotting charakterisiert werden. Mit Hilfe von NTA kann die Analyse der Partikelausbeute eine erhöhte Konzentration in den isolierten EVs im Vergleich zu CM bestätigen (Abbildung 3A). Western-Blot-Daten bestätigen ferner die Expression des zytolytischen Markers Granzym B in CAR-Zellen und EVs und die Abwesenheit von Calnexin in letzteren, was die Abwesenheit von zellulärem Material in Präparaten bestätigt. HEK293T Zellen sind als CAR-Negativkontrolle enthalten (Abbildung 3B).
Die Analyse der EV-Funktionalität wurde mittels MTS-Assay durchgeführt, um die Lebensfähigkeit/Proliferationskapazität der Zellen zu bestimmen. Die Wirkung von EGFR- und HER2-gerichteten CAR-EVs auf die Lebensfähigkeit und das Wachstum von MCF-7-Brustkrebs- und K562-Blutkrebszellen wird durch Messung des kolorimetrischen MTS-Reagenzes bei einer Extinktion von 490 nm (nach Entfernung des Hintergrundsignals) bestimmt. In diesem Beispiel reduzierte EGFR, das auf CAR-EVs abzielte, die Viabilität von MCF-7- und K562-Zellen um 70 % bzw. 40 %. HER-2, das auf CAR-EVs abzielte, reduzierte MCF-7 um ~10 % (wie durch den Student's t-Test bestimmt). Unter Berücksichtigung des experimentellen Aufbaus kann die Verwendung eines nicht-parametrischen Tests (z. B. Mann-Whitney U) in nachfolgenden Studien robustere Erkenntnisse bieten (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig1.jpg"> 
Abbildung 1: CAR-EV-Generierung, Anreicherung, EV-Charakterisierung und Funktionsauslesung. Schematisches Diagramm, das einen typischen Arbeitsablauf für die Erzeugung, Produktion und Charakterisierung von angereicherten CAR-EV-Proben vor der Analyse der Funktionalität darstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Repräsentative mikroskopische Analyse durch Bestätigung der GFP-Expression in HER2-targetingierenden CAR-T-Zellen. Die Bilder wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem 20-fachen Objektiv aufgenommen. Der weiße Maßstabsbalken stellt eine Länge von 50 μm dar. T-Zellen haben eine natürliche Tendenz, in Klumpen zu wachsen, bevor sie sich in einzelne Zellen ablösen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Charakterisierung von CAR-Zellen und EVs. (A) Nano-Tracking-Partikelanalyse von CAR-T CM und angereicherten EVs. Die Partikelkonzentration von EVs war 1,6-2,1-mal höher als die von CM, während die Proteinkonzentration um &gt;80% reduziert wurde. Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit der Einweg-ANOVA und dem Mehrfachvergleichstest von Tukey getestet; p≤ 0,001, **** p≤ 0,0001. (B) Die Western-Blot-Analyse von transduzierten T-Zellen und angereicherten CAR-EVs bestätigte das Vorhandensein von zytolytischem Granzym B sowohl in CAR-Zellen als auch in EVs, während in HEK293T Nicht-CAR-Zellen ein Fehlen festgestellt wurde. Calnexin wurde in CAR-EV nicht nachgewiesen, was auf eine geringe Kontamination durch endoplasmatische Retikulumpartikel hinweist. Proteinbelastung pro Bahn = 5 μg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Wirkung von CAR-EVs auf die Lebensfähigkeit der Zielzellen (MCF-7 Brustkrebszellen und K562 chronische myeloische Leukämie-Zelllinie). Die Zielzellen wurden mit einer Einzeldosis von 4,5 x 105 und 2,5 x 105 EVs/Zelle (EGFR bzw. HER2 CARs) oder Kontrolle (EV-Puffer) für bis zu 3 Tage behandelt. (A) CAR-EVs-Zellen, die auf EGFR abzielen. (B) HER2-zielgerichtete CAR-EVs. In beiden Zelllinien wurde eine Abnahme der Absorptionswerte (ein Hinweis auf die Wirksamkeit der Behandlung) beobachtet. Die Daten stellen die mittlere Absorption ± SD (n = 3) dar, die mit einem zweiseitigen, ungepaarten Student's t-Test analysiert wurde, wobei die p-Werte eine statistische Signifikanz anzeigen; ** p≤ 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Verbesserung der Technologie für chimäre Antigenrezeptor-extrazelluläre Vesikel (CAR-EV): Die Zukunft der Krebstherapie

CAR cell therapies have significantly advanced personalized treatment for several hematological malignancies. Currently, seven CAR-&#8239;cell products ...

enhancing-chimeric-antigen-receptor-extracellular-vesicles-car-ev

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen ex vivo. Menschliche T-Zellen werden mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, zusammen mit einem mit Interleukin-2 (IL-2) angereicherten Medium, was zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Zellen führt. Transgene lentivirale Vektoren werden eingeführt, die es der transgenen RNA ermöglichen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren und...

Eine ex vivo-Technik zur Herstellung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Die lymphodepletiven und immunmodulatorischen Effekte von Chemotherapie und Bestrahlungsstandard können genutzt werden, um die Antitumorwirksamkeit der T-Zell-Immuntherapie zu verbessern. Wir skizzieren eine Methode zur Erzeugung von EGFRvIII-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen und deren Verabreichung im Rahmen der Glioblastom-Standardtherapie.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokultur Methode rekursiv Herausforderung Tumor gezielt T-Zellen, die phänotypische und funktionelle Analyse der Antitumor-T-Zell-Aktivität ermöglicht.

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen unter Verwendung von nicht-integrierender mRNA für die Krebsimmuntherapie und bietet zuverlässige Methoden zur Bewertung von CAR-T-Zellen und ihrer zytotoxischen Funktion.

Ein nicht-viraler Ansatz zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen unter Verwendung von mRNA für die Krebsimmuntherapie

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte zur Kultivierung primärer T-Zellen, einschließlich ihrer Isolierung, Aktivierung, Expansion und transienten Transfektion durch mRNA-Elektroporation. Zusätzlich werden ein Workflow und ein Antikörperpanel für die Durchflusszytometrie von Phänotyp, Aktivierungsmarkern, Viabilität und der Expression des chimerischen Antigenrezeptors (CAR) vorgeschlagen.

Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen

Das Aufkommen der ortsspezifische Rekombinase (SSR)-Technologie und des Cre / lox-System hat zu zahlreichen Fortschritte in der Molekularbiologie geführt, und hat sich als ein wertvolles Instrument für die Beurteilung der Funktion von Genen in transgenen Tieren. Dieses Interview beschreibt den Mechanismus der ortsspezifischen Rekombination durch Cyclisierung Rekombinase (Cre) und wie der Einsatz dieses Enzyms hat zur Entwicklung des bedingten Mutagenese, die erhebliche Vorteile gegenüber...

Principles of ortsspezifische Rekombinase (SSR)-Technologie

Erfahren Sie die Entwicklung von CAR-EVs für die Krebstherapie mittels Ionenaustauschchromatographie und Nanopartikel-Tracking-Analyse. Diese Methode ermöglicht die gezielte Abgabe therapeutischer Wirkstoffe an Tumorzellen.

Verbesserung der Technologie für chimäre Antigenrezeptor-extrazelluläre Vesikel (CAR-EV): Die Zukunft der Krebstherapie

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