Verbesserung der Technologie für chimäre Antigenrezeptor-extrazelluläre Vesikel (CAR-EV): Die Zukunft der Krebstherapie

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung von Exosomen-basierten Diagnostika und Therapeutika. Ein Ziel ist die Entwicklung von chimären Antigenrezeptor-Exosomen-basierten Therapeutika, die sicherer, wirksamer und zugänglicher als zellbasierte Therapien sind, für die Behandlung von Seitentumoren. Unsere EXO-NET- und EXO-ACE-Plattformen ermöglichen eine skalierbare, reproduzierbare und GMP-konforme Exosomenisolierung mit hoher Ausbeute und Reinheit und überwinden damit die Einschränkungen traditioneller Methoden für Forschung und Therapeutika.

EXO_NET net und EXO-ACE ermöglichen eine schnelle, skalierbare und GMP-konforme EV-Isolierung mit überlegener Reinheit und Reproduzierbarkeit und übertreffen die Zentrifugation und Fällung für Forschung, Diagnostik und therapeutische Anwendungen. Wir haben eine schnelle, skalierbare und validierte Methode entwickelt, um CAR-EVs zu entwickeln und zellfreie, zielgerichtete Therapeutika der nächsten Generation bereitzustellen. Dies bietet einen robusten Arbeitsablauf, der auf andere Krankheitszustände angewendet werden kann, bei denen ein klinischer Bedarf besteht.

Unser nächstes Ziel ist es, die von uns entwickelten und validierten Methoden zur Generierung von CAR-EVs für die Verabreichung von RNA-Therapeutika zur Behandlung von soliden Tumoren und anderen entzündlichen Erkrankungen zu nutzen. Bringen Sie die Ionenaustauschersäule zunächst auf Raumtemperatur, indem Sie sie 15 Minuten lang aufrecht stehen lassen. Mit einer Pipette 10 Säulenvolumina Regenerationspuffer hinzufügen, gefolgt von 10 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer.

Lassen Sie das thod-konditionierte Medium durch einen 0,22-Mikrometer-Polyethersulfonfilter. Fügen Sie nun bis zu 31,2 Säulenvolumina der gefilterten Probe in die äquilibrierte Säule hinzu. Fügen Sie dann 10 Säulenvolumina Waschpuffer hinzu, gefolgt von 2,5 Spaltenvolumina Elutionspuffer.

Sammeln Sie den Durchfluss, der die angereicherten extrazellulären Vesikel enthält. Unter Verwendung von 30-Kilodalton-Ultrafiltrationszentrifugalfiltern und einem Verdünnungsmittel wird der Pufferaustausch an der extrazellulären Vesikelelue durchgeführt, um eine mindestens 100-fache Verdünnung zu gewährleisten. Passen Sie das endgültige Volumen der ausgetauschten Lösung basierend auf den experimentellen Anforderungen an.

Die angereicherte extrazelluläre Vesikelprobe wird durch einen 0,22-Mikrometer-Filter geleitet, um sie für In-vitro-Assays zu sterilisieren. Bestimmen Sie die Größenverteilung, Konzentration und Ausbeute von extrazellulären CAR-Vesikeln mithilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse. Für eine extrazelluläre Pan-Exosomen-Vesikelisolierung mit hohem Durchsatz schalten Sie das Gerät ein und melden Sie sich an.

Konfigurieren Sie die Einstellungen, um das HT EV-Proteinisolationsprotokoll einzurichten. Bereiten Sie eine Spitzenkammplatte vor, indem Sie einen Spitzenkamm in eine 96-Well-Deep-Well-Platte legen. Geben Sie einen Milliliter PBS in jede Vertiefung, um drei Waschplatten vorzubereiten.

Bereiten Sie nun eine Elutionsplatte vor, indem Sie 35 Mikroliter 1 %SDS-Puffer in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte pipettieren. Bereiten Sie dann eine Bindeplatte vor, indem Sie einen Milliliter des konditionierten Mediums hinzufügen. Starten Sie auf dem automatisierten Isolationssystem das Protokoll, indem Sie das Programm HT EV Protein Isolation Protocol auswählen und die Wiedergabetaste auswählen.

Öffnen Sie das Instrument, um mit dem Einlegen der Platten zu beginnen. Befolgen Sie die Anweisungen des Instruments und legen Sie die vorbereiteten Elutionsplatten und anschließend die Deep-Well-Platten mit drei Waschgängen in das Instrument ein. Geben Sie kurz vor dem Laden der Bindungsplatte 30 Mikroliter Pan-Exosomen-Capture-Kügelchen in jede Vertiefung.

Legen Sie die Bindeplatte in das Instrument ein, legen Sie dann die Kammplatte der Spitze ein und schließen Sie das Instrument, um die Bindung zu starten. Das System mischt die konditionierte Mediumprobe und die magnetischen Beads kontinuierlich mit langsamer Geschwindigkeit für 30 Minuten und erleichtert so die effiziente Erfassung extrazellulärer Vesikel. Lassen Sie das System nach Abschluss des Bindeschritts drei Waschschritte ausführen und mischen Sie 30 Sekunden lang mit langsamer Geschwindigkeit, um unspezifische Verunreinigungen zu entfernen.

Ermöglichen Sie dem automatisierten System, die extrazelluläre Vesikellyse für die Proteinrückgewinnung zu initiieren, indem Sie einen 30-Sekunden-Bottom-Mix durchführen. Während der Inkubation pausiert das Instrument für sieben Minuten und 30 Sekunden, während die Pipettenspitzen über jeder Vertiefung positioniert bleiben. Starten Sie einen weiteren Mix von 30 = Sekunden, gefolgt von einer weiteren Pause von sieben Minuten und 30 Sekunden.

Wenn das Protokoll abgeschlossen ist, hebt das System den gebrauchten Spitzenkamm an, wobei die Lösung in der 96-Well-Platte verbleibt und die magnetischen Kügelchen an den Spitzen befestigt sind. Schließlich fährt das Instrument mit dem Auslassschritt fort und führt den Spitzenkamm wieder in die Spitzenkammplatte ein. Öffnen Sie das Instrument und entfernen Sie die Platten.

Die GFP-Fluoreszenz bestätigte die CAR-Expression in transduzierten T-Zellen, wobei die Lokalisation in Zellclustern offensichtlich war und die Kolokalisation durch Überlagerung von Hellfeld- und GFP-Kanälen verifiziert wurde. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigte eine signifikant höhere Konzentration extrazellulärer Vesikel in der angereicherten EV-Fraktion im Vergleich zu konditionierten Medien sowohl für EGFR- als auch für HER2-CAR-Konstrukte. Western Blot bestätigte das Vorhandensein von Granzym B in CAR-exprimierenden Zellen und in den isolierten extrazellulären Vesikel, wobei Calnexin in den extrazellulären Vesikeln fehlte, was auf eine fehlende zelluläre Kontamination hinweist.

EGFR-gerichtete extrazelluläre CAR-Vesikel reduzierten die Lebensfähigkeit von MCF-7-Brustkrebszellen signifikant um 70 % und die Lebensfähigkeit von K-562-Blutkrebszellen um 40 %. HER2-gerichtete extrazelluläre Car-Vesikel zeigten eine Verringerung der Lebensfähigkeit von MCF-7-Brustkrebszellen um etwa 10 %, während sie keine beobachtbare Wirkung auf K-562-Blutkrebszellen hatten.