Steuerbare in vivo Reprogrammierung von Tumorzellen zu konventionellen dendritischen zellähnlichen Zellen vom Typ 1

Wir untersuchen in vivo die Programmierung von Krebszellen in cDC1-ähnliche Zellen als neuartige Immuntherapiestrategie. Unser Ziel ist es, herauszufinden, ob dieser Ansatz immunkalte Tumore in immunwarme Tumore umwandeln kann, um eine Anti-Tumor-Immunität zu erreichen. Wir gehen auf die Grenzen der aktuellen in vivo cDC1-Erzeugungsstrategien ein, indem wir ein Protokoll vorstellen, mit dem Krebszellen direkt im Tumor in immunogene cDC1-ähnliche Zellen umgewandelt werden können, was die Untersuchung von cDC1-gesteuerten Immunantworten in situ ermöglicht.

Unser handhabbares In-vivo-Programmierprotokoll erzeugt zuverlässig reife immunogene cDC1-ähnliche Zellen, die die suppressive Tumormikroumgebung überwinden, und da diese Zellen direkt in vivo erzeugt werden, macht dieser Ansatz die Herstellung von In-vitro-Immunzellen überflüssig. Unsere Ergebnisse bilden eine Grundlage für die Übertragung der In-vivo-Transkriptionsfaktor-vermittelten Reprogrammierung auf die Klinik und die Einführung einer handelsüblichen, aber personalisierten Krebsimmuntherapie, die dauerhafte Anti-Tumor-Immunantworten hervorruft. In Zukunft untersuchen wir, wie die Reprogrammierung von cDC1-ähnlichen Zellen die Bildung von Tertiär- und Infrastrukturzellen auslösen kann und ob sich dies in einer humoralen Immunität niederschlägt.

Darüber hinaus untersuchen wir auch die potenzielle Synergie mit anderen immuntherapeutischen Ansätzen. Kultivieren Sie zunächst die HEK 293T-Zellen, bis sie eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen. Nun wird die vorbereitete Transfektionsmischung, die das Transferplasmid enthält, eine Minute lang gründlich vorgewirbelt und die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bildung eines DNA-Lipidkomplexes zu ermöglichen.

Aspirieren Sie das Medium aus den HEK 293T-Zellen und fügen Sie 10 Milliliter DMEM ohne Penicillin-Streptomycin hinzu und ergänzen Sie es mit 10%FBS. Geben Sie dann die Transfektionsmischung tropfenweise auf die 150-Millimeter-Platten und inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie nach der Inkubation das Medium durch 20 Milliliter DMEM-Vollmedium, das mit einem Millimolar Natriumbutyrat ergänzt ist, und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Als nächstes sammeln Sie den Lentivirus-haltigen Überstand 48 und 60 Stunden nach der Transfektion in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Nach der ersten Sammlung fügen Sie für die zweite Ernte 12 Milliliter vorgewärmtes komplettes DMEM pro 150-Millimeter-Platte hinzu. Filtrieren Sie die gesammelte Flüssigkeit durch einen 0,45 Mikrometer großen, proteinarmen Polyethersulfonfilter.

Pipettieren Sie 37 Gramm des Lentivirus-haltigen Mediums in 38,5 Milliliter dünnwandige Polypropylen-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einem schwingenden Schaufelrotor bei 25.000 G für 90 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgesaugt, ohne das Pellet zu stören.

Legen Sie die oben offenen, dünnwandigen Polypropylenschläuche fünf Minuten lang kopfüber auf ein Labortuch oder ein ähnliches saugfähiges Material, um überschüssige Flüssigkeit abzulassen und das Pellet zu trocknen. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter eiskaltes DMEM, ergänzt mit HEPES oder PBS, zu jedem Pellet und geben Sie die Mischung in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist. Inkubieren Sie das Pellet über Nacht bei vier Grad Celsius, um eine vollständige Resuspension zu ermöglichen.

Kombinieren Sie alle resuspendierten Pellets in einem einzigen Behälter, aliquotieren Sie den Virusfond in kleinere Volumina zwischen 50 und 200 Mikrolitern und lagern Sie ihn für den Langzeitgebrauch bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie nach der Expansion der Krebszellen die Zellsuspensionen für die Transduktion vor, um am dritten Tag ein Verhältnis von EGFP-positiven zu EGFP-negativen Zellen zu erreichen. Geben Sie acht Mikrogramm pro Milliliter Polybren in die Zellsuspension, gefolgt von dem entsprechenden Volumen Lentivirus, wie zuvor bestimmt.

Mischen Sie den Inhalt schonend, ohne Blasen zu erzeugen. Pipettieren Sie nun zwei Milliliter der vorbereiteten Zellsuspension, die eine mal 10 hoch fünf Zellen enthält, in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie nach 24 Stunden das lentivirushaltige Medium aus jeder Vertiefung.

Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS. Geben Sie 500 Mikroliter Trypsin in jede Vertiefung und inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Untersuchen Sie anschließend die Vertiefungen unter einem Lichtmikroskop, um die vollständige Zellablösung von der Platte zu bestätigen.

Sammeln Sie dann die Zellen mit vollständigem Medium in konische 50-Milliliter-Röhrchen. Die Zellen werden fünf Minuten lang bei 350 g zentrifugiert, um sie zu pelletieren. Waschen Sie das Pellet mit PBS.

Nehmen Sie ein Aliquot und bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen mit einem Hämozytometer und einer Trypanblau-Färbung. Als nächstes wird das endgültige Zellpellet in eiskaltem PBS resuspendiert, um eine Konzentration von zwei- bis viermal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter zu erreichen, was ein- bis zwei mal 10 hoch der Leistung von sechs Zellen in 50 Mikrolitern pro Tumor entspricht. Lege die Zellen auf Eis und siedele sie in den Tierversuchsbereich um.

Nachdem Sie die CD45.1-Maus betäubt haben, legen Sie sie auf ein Wärmekissen, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Tragen Sie Augencreme auf die Maus auf, um eine Austrocknung der Augen während der Anästhesie zu verhindern. Rasieren Sie mit einem Rasiermesser die rechte Flanke der Maus.

Optional können Sie die Maus mit einem Ohrknipser markieren. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich und entfernen Sie verbleibende Haare mit einem in 70 % Ethanol getauchten Tupfer. Nun werden die Krebszellen mit einer P1000-Pipette gründlich resuspendiert.

Laden Sie die vollständig resuspendierte Zellsuspension in eine 0,5-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Heben Sie die Haut an der rasierten Flanke der Maus vorsichtig mit zwei Fingern an und führen Sie die Spritzennadelspitze in die Falte ein, die durch die angehobene Haut gebildet wird. Lösen Sie die angehobene Haut, während Sie die Spritze mit einer Hand an Ort und Stelle halten.

Dehnen Sie mit der anderen Hand die Hautoberseite mit zwei Fingern. Injizieren Sie langsam 50 Mikroliter der Krebszellsuspension, um eine sichtbare ovale subkutane Schwellung an der Injektionsstelle zu erzeugen. Überwachen Sie das Tier nach der Injektion, bis es vollständig aus der Narkose erwacht ist, um das Überleben zu sichern.

HEK 293T-Zellen, die mit dem SFFV-PIB-eGFP-Plasmid transfiziert wurden, zeigten 24 Stunden nach der Transfektion eine klare eGFP-Expression, was eine erfolgreiche Plasmaabgabe bestätigt. 72 Stunden nach der Transduktion zeigten die Melanomzellen eine erfolgreiche Verabreichung der Reprogrammierungsfaktoren und des eGFP. Am neunten Tag nach der Implantation der Zellen ergab die In-vivo-Reprogrammierung einen höheren Prozentsatz an vollständig reprogrammierten CD45-positiven, MHC-II-positiven, cDC1-ähnlichen Zellen als unter In-vitro-Bedingungen.

Am dritten Tag nach der Implantation zeigten PIB-eGFP-Tumoren eine deutlich höhere CD45-positive Immunzellinfiltration als eGFP-Kontrollen, was auf einen frühen Immunumbau hindeutet. Am neunten Tag war die mittlere CD45-Fluoreszenzintensität pro Tumorbereich bei PIB-eGFP-Tumoren signifikant höher als bei Kontrollen. Tertiäre lymphoide Strukturen wurden in PIB-eGFP-Tumoren bis zum neunten Tag nachweisbar, was auf strukturelle Immunveränderungen in der Tumormikroumgebung hinweist.