SCAnED - Ein Open-Source-Hautsegmentierungsmakro für die halbautomatische Zell- und Zellkerndetektion in epidermalen und dermalen Hautkompartimenten

In unserer Arbeit untersuchen wir regulatorische Mechanismen, die die Gewebehomöostase auf molekularer, zellulärer, struktureller und mechanischer Ebene aufrechterhalten. Unser Ziel ist es, pathologische Zustände wie Hautentzündungen oder Krebs zu verstehen. Mit neuen hochauflösenden Bildgebungs- und Multiomics-Tools können wir nun zelluläre und Genexpressionsänderungen in Geweben in 2D und 3D kartieren.

Das erweitert wirklich unser Verständnis darüber, wie sich Krankheiten entwickeln und verlaufen. Eine der großen Herausforderungen ist derzeit die enorme Datenmenge, die durch fortschrittliche Mikroskopie erzeugt wird. Und obwohl es mehr Werkzeuge zur Bildanalyse gibt, sind sie oft nicht benutzerfreundlich für Menschen ohne viel Erfahrung oder ziemlich teuer.

Unser Protokoll bietet ein kostenloses, benutzerfreundliches Tool zur Analyse menschlicher Hautzellen sowohl in der Epidermis als auch in der Dermis. Es verbessert die Genauigkeit gegenüber allgemeinen Werkzeugen und erfordert keine Programmierkenntnisse oder Bildanalyse. Zu Beginn öffnen Sie die Immunfluoreszenzbilder in Fiji oder Bild J mit Bio-Formaten und den Standardeinstellungen.

Trennen Sie die Kanäle während dieses Schritts nicht. Lade das SCAnED-Makro herunter und führe es aus, indem du Plugins auswählst. Dann Makros und das Klicken auf Ausführen.

Wählen Sie die SCAnED-Makroskriptdatei aus, wenn Sie aufgefordert werden. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm im Makro. Wählen Sie den E-Cadherin-Kanal, wenn das Makro dazu auffordert.

Als Nächstes navigieren Sie zum Bild, wählen Sie anpassen und dann Schwellenwert, um die Schwelle für den E-Cadherin-Kanal manuell anzupassen. Klicken Sie auf OK, sobald die Epidermisregion vollständig erfasst ist. Wählen Sie dann den DAP-E-Kanal aus, wenn Sie aufgefordert werden, um mit der Segmentierung fortzufahren.

Definieren Sie automatisch die Intensitätsniveaus für die Kernsegmentierung bei Verwendung der Schwellenfunktion. Für StarDist öffnen Sie das Plugin in Bild J. Laden Sie das Kernerkennungsmodell in die grafische Oberfläche von StarDist und klicken Sie auf den Kernkanal, um ihn zur Analyse auszuwählen. Passen Sie nun die Kacheleinstellungen in StarDist so an, dass sie der erwarteten Patchgröße von 256 mal 256 Pixeln entsprechen.

Wenn Sie aufgefordert werden, wählen Sie Ja, um die Markerintensität innerhalb der Kerne zu messen. Anschließend wiederholen Sie den Segmentierungs- und Analyseprozess für jeden Fluoreszenzkanal. Nachdem alle Kanäle verarbeitet sind, speichern Sie die Ausgabedaten als kommagetrennte Wertdateien, wie vom Makro angewiesen.

Für die zytoplasmatische Region wird bei der Segmentierung der Kerne mit der Schwellenfunktion eine binäre Dilatation angewendet, um den interessierenden Kernbereich zu erweitern. Wenn StarDist für die Kernsegmentierung verwendet wurde, wende die Erweiterung auf die Kernregion von Interesse an. Wähle Ja, wenn du aufgefordert wirst, um die Markerintensität im gesamten Zellbereich zu messen.

Speichere dann die resultierenden Datendateien als kommagetrenntes Werteformat gemäß Makroanweisungen. Bestimmen Sie markerspezifische Intensitätsschwellenwerte mit Isotyp-Kontrollproben. Laden Sie das entsprechende Jupyter-Notizbuch herunter und gehen Sie zu Google Collab, um die Datei auszuwählen, gefolgt von "Notizbuch öffnen".

Wähle die Datei aus und führe die Codezellen nacheinander aus. Wenn Sie mit der Option "Dateien auswählen" angezeigt werden, klicken Sie auf den Button und laden Sie die Komma-getrennte Wertdatei hoch. Für jeden Antikörper berechnet man die mittlere Fluoreszenzintensität mit den Isotyp-Kontrolldateien.

Um die Cutoff-Schwellenwerte zu bestimmen, öffnen Sie das Dot-Plot-Notizbuch, laden Sie die Isotyp-Steuerdaten hoch und führen Sie den Code aus. Basierend auf der Verteilung der Punkte in den Diagrammen sowohl für Isotypkontrolle als auch für spezifische Antikörperdaten wählen Sie eine Intensitätsschwelle, um Hintergrundsignal von echter Markerexpression zu unterscheiden. Verwenden Sie diesen Schwellenwert, um jede Zelle als positiv oder negativ für den gegebenen Marker zu klassifizieren.

Erstellen Sie schließlich Punktdiagramme, um Koexpressionsmuster von Markern zu visualisieren, indem Sie den Punktdiagramm-Code im Google Collab-Notizbuch ausführen. In manuell segmentierten Bildern zeigten Vimentin-positive Zellen ein starkes zytoplasmatisches Signal mit klaren ROI-Grenzen, die den gesamten Zellkörper abdeckten. Die semi-automatisierte Segmentierung von SCAnED erfasste Vimentin-positive Zellen mit ähnlichen Grenzen mithilfe eines Schwellenwert- und Dilatationsansatzes.

Der quantitative Vergleich der Vimentinintensität in 21 Zellen zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen manueller und SCAnED-Segmentierung. Die Histogrammanalyse zeigte eine höhere Häufigkeit von Vimentin-positiven Zellen in der Psoriasis-Dermis im Vergleich zu gesunder Haut. Die Dot-Plot-Analyse der Hautzellen zeigte eine erhöhte CD-90-positive Vimentin-positive Zelle bei Psoriasis im Vergleich zu gesunder Haut.

In der Epidermis zeigten Psoriasis-Proben einen Anstieg von CD-90-positiven Vimentin-negativen Zellen, möglicherweise Keratinozyten, im Vergleich zu gesunder Haut. Die Vimentin-positiven Zellzählungen in der psoriatischen und gesunden Epidermis waren zwischen SCAnED und QuPath vergleichbar. Die visuelle Segmentierung zeigte, dass SCAnED Grenzzellen der Epidermis genauer zuordnete als QuPath, das mehrere falsch zuteilte.