Entwicklung von mausabgeleiteten Organoidlinien aus Epithelzellen des Eileiters für die Modellierung des hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms

Ja, wir arbeiten derzeit an der Entwicklung neuartiger Modelle für hochgradiges seröses Ovarialkarzinom, Modelle, die syngen sind, wie es das Protokoll beschreibt. Wir nehmen die gesunden Eileiter von gesunden Mäusen, leiten sie als Organoide in der Petrischale ab und geben ihnen alle möglichen Fehler oder genetischen Modifikationen, die wir normalerweise in einer normalen menschlichen Version der Krankheit finden würden. Das ist sehr interessant, denn auf der einen Seite kann man alle möglichen intrinsischen Faktoren dieser Tumore in der Petrischale als Organoide untersuchen, die realistischer sind als traditionelle 2D-Kulturen.

Aber da es syngene Modelle gibt, kann man diese Organoide nehmen und wieder in eine Maus einsetzen, um zu sehen, wie sich der Tumor tatsächlich entwickelt und mit dem Wirt interagiert. Das ermöglicht es uns, eine viel ganzheitlichere Sicht darauf zu haben, wie ein Tumor und die Tumorgenese tatsächlich ablaufen, was uns hoffentlich bessere Werkzeuge und ein besseres Verständnis dafür verschafft, wie diese Krankheit tatsächlich funktioniert und wie man sie besser bekämpfen kann. Um zu beginnen, holen Sie sich eingeschläferte weibliche C57 schwarze 6J-Mäuse.

Entfernen Sie den Eierstock und den Eileiter und bringen Sie sie in eine sterile Petrischale mit DMEM, ergänzt mit Penicillinstreptomycin bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie ein Sezionsmikroskop, eine feine Zange und eine Schere, um Restfett aus dem Eierstock zu entfernen. Isolieren Sie den Eileiter, einschließlich des Infundibulums und eines Teils der distalen Ampulle vom Eierstock und der Gebärmutter.

Nun wird das gereinigte Gewebe in ein Rohr mit der vollständigen Verdauungsmischung übertragen. Mit einer feinen Schere wird der Eileiter in Stücke kleiner als 0,5 Millimeter zerkleinert. Anschließend wird das Rohr bei 37 Grad Celsius für 40 bis 50 Minuten inkubiert, bevor die Organoid-Kultivierung durchgeführt wird.

Um das Maustumormodell zu entwickeln, wurden fünf Injektionen eingerichtet, von denen jede vier Millionen Zellen enthält, die in unsupplementiertem Opti-MEM I, einer eiskalten Basalmembranmatrix, resuspendiert sind. Um die Injektionen vorzubereiten, stoßen Sie zunächst Luftblasen aus dem toten Volumen einer U-100-Insulinspritze, die mit einer 28-Gauge-Nadel versehen ist, mit kaltem PBS aus. Dann wird die Spritze langsam mit 40 Mikrolitern Zellen geladen und die geladenen Spritzen auf Eis gelegt, bis die Mäuse betäubt sind.

Sobald die Injektion bereit ist, platzieren Sie die Spritzen neben eine Heizlampe, damit die Basalmembranmatrix erwärmt und die Viskosität erhöht wird, was die Injektion und Einpflanzung erleichtert. Setzen Sie als Nächstes eine Maus in einen vorgewärmten Käfig unter eine Heizlampe, um sich auf die Operation vorzubereiten. Machen Sie einen Schnitt von weniger als einem Zentimeter entlang der Flanke, oberhalb des Oberschenkels einer betäubten Maus.

Schneiden Sie durch die Epidermis und Hypodermis, um die Bursa-Region zu erreichen. Ziehe den Eierstock vorsichtig heraus, indem du das befestigte Fettpolster suchst. Dann werden Zellen mit einer vorbereiteten Spritze durch das Fettpad und den Eierstock in den Eileitersack injiziert.

Setzen Sie den Eierstock vorsichtig zurück in die Bursa. Schließe die Muskelschicht mit nicht geflochtenen Nähten. Schließen Sie anschließend den Hautschnitt mit chirurgischen Klammern.

Setzen Sie die Maus zurück in den erwärmten Käfig und halten Sie die Körpertemperatur mit einer Heizlampe, bis sie halb bewusst ist, meist für mehr als 15 Minuten. Organoide, die aus dem Epithel der Maus-Eileiter stammen, haben nach etwa fünf Tagen eine klar definierte kugelförmige und klare Form und müssen etwa von Tag 10 bis 12 verpackt werden. Die Wildtyp-Organoide werden durch genetische Techniken, wie etwa lentivirale oder retrovirale Genüberexpression, in Vorstufentumoroide umgewandelt.

Einzelklonzelllinien, die aus den genetisch veränderten Organoiden abgeleitet sind, können in vivo durch Injektion in die Ovarialbursa weiter untersucht werden. Tumore erreichen typischerweise etwa 60 Tage nach der Injektion eine Größe von zwei bis drei Zentimetern. Nun, wir sagen wirklich, wie ich bereits angedeutet habe, der größte Vorteil, dass dieses Protokoll funktioniert, ist natürlich, diese syngenen Modelle zu generieren, richtig?

Und da sie syngen sind, wie ich schon sagte, kann man die ganze Interaktion zwischen einem vollständigen Tier, einer kompletten Maus und dem Tumor, den man entwickelt, wirklich schätzen, während man die Genetik des Tumors vollständig kontrolliert. Und natürlich wird es im Vergleich zu anderen Modellen, bei denen man vielleicht versuchen wird, das Immunsystem in der Petrischale zu verstehen, sehr schwierig sein, das Immunsystem in der Petrischale zu replizieren. Oder wenn man PDXs nimmt, also Tumorproben von Patienten, die man dann in Mäuse einsetzt, damit das funktioniert, können die Mäuse kein Immunsystem haben, sonst stoßen sie diesen Tumor ab, richtig?

Da dieses Modell syngen ist, kann man die gesamte Interaktion des gesamten Wirts mit dem Tumor und insbesondere mit dem Immunsystem wirklich schätzen, das derzeit eines der heißesten Forschungsgebiete auf diesem Gebiet ist. Ich denke also wirklich, dass das der wichtigste Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zu anderen Protokollen ist, die man anderswo findet. Tatsächlich haben wir diese Modelle bereits verwendet, um einige sehr interessante Phänomene zu untersuchen.

Ich würde sagen, das Thema, das mich gerade besonders interessiert, ist, wie das adaptive Immunsystem, soweit wir gesehen haben, ein wesentlicher Beitrag zur Gestaltung genomischer Eigenschaften zu sein scheint, insbesondere der Kopienzahlvariationen hochgradiger seröser Ovarialkarzinome, im Sinne dessen, dass wenn das Immunsystem nicht vorhanden ist, diese Tumore offenbar keine so massiven und komplexen DNA-Umordnungen entwickeln. Deshalb versuchen wir herauszufinden, wie das passieren kann und wie wir es hoffentlich umkehren können, um jegliche Art von Immuntherapien dagegen zu verstärken.