Stimulation von vaskulären Endothelzellen mit Hilfe von extrazellulären Fallen für Neutrophile in Gegenwart von Lipoproteinen niedriger Dichte

Neutrophile extrazelluläre Fallen sind an einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Die synergistischen Effekte der NET-Bildung und der Lipoproteine auf die Gefäßzellen sind jedoch noch unklar. Unter Verwendung dieses Protokolls wird bis heute mechanistisch analysiert, wie Entzündungsreaktionen in menschlichen Aorten-Endothelzellen induziert werden, die mit neutrophilen extrazellulären Fallen und Lipoproteinen niedriger Dichte behandelt werden.

Wir haben gezeigt, dass High-Density-Lipoprotein als Suppressor der NET-Bildung wirkt. Dies wird durch oxidiertes Low-Density-Lipoprotein, oxidierte Phospholipide und Lysophospholipide gefördert. Zu Beginn zentrifugieren Sie 45 bis 50 Milliliter menschliches Vollblut, das in einem Heparinröhrchen bei 700 g gewonnen wurde, 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Reduzieren Sie die Zentrifugengeschwindigkeit nach dem Schleudern langsam und sammeln Sie dann die obere Schicht mit der Plasmafraktion. Zentrifugieren Sie die Plasmafraktion zweimal bei 700 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Blutzellen vollständig zu entfernen, wobei die gleiche Verzögerungseinstellung beibehalten wird. Fügen Sie dann einen Mikroliter 250 millimolare EDTA-Lösung pro Milliliter Plasma hinzu, um eine durch zweiwertige Metallionen vermittelte Oxidation von Lipoproteinen zu verhindern.

Geben Sie 2,7 Milliliter des Plasmas in das Ultrazentrifugenröhrchen. Overlay mit 900 Mikrolitern PBS mit 250 mikromolaren EDTA. Dann ultrazentrifugieren Sie das Röhrchen bei 600.000 g für sieben Minuten bei vier Grad Celsius.

Als nächstes verwerfen Sie 900 Mikroliter aus der obersten Schicht, um die Chylomikron-Fraktion zu eliminieren. Fügen Sie 900 Mikroliter PBS mit EDTA zum restlichen Plasma hinzu und zentrifugieren Sie es bei 600.000 g für 2,5 Stunden bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie 900 Mikroliter der obersten Schicht, um die Lipoproteinfraktion mit sehr geringer Dichte zu eliminieren.

Geben Sie dann 540 Mikroliter 0,5 Gramm Kaliumbromidlösung pro Milliliter in das Plasma, um die Dichte auf 1,063 einzustellen. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig mit einer Pipette und einer Ultrazentrifuge bei 600.000 g für 2,5 Stunden bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie 540 Mikroliter der obersten Schicht, die Lipoprotein niedriger Dichte enthält.

Die gesammelte Fraktion wird in eine Dialysemembran überführt und gegen zwei Liter EDTA-haltiges PBS bei vier Grad Celsius im Dunkeln dialysiert, um Kaliumbromid zu eliminieren. Geben Sie 152 Mikroliter 0,01 % Polylysin oder 0,1 % Gelatinelösung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie sie mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nehmen Sie dann die Lösung aus den Vertiefungen, waschen Sie sie einmal mit 200 Mikrolitern sterilem Wasser und lassen Sie die Vertiefungen vollständig bei Raumtemperatur trocknen.

Lagern Sie die vorbereitete Platte bis zur weiteren Verwendung bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die mit Gelatine beschichteten Platten nach dem gleichen Verfahren vor, das für Polylysin gezeigt wird. Kultivieren Sie zwei mal zehn hoch sechs HL60-Zellen pro 10 Milliliter in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit zwei mikromolaren all-trans-Retinsäure.

Nach viertägiger Inkubation mit all-trans-Retinsäure sammeln Sie die HL60-Zellen. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen bei 220 g für vier Minuten bei 18 bis 22 Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen dann mit einem gleichen Volumen serumfreiem RPMI-1640-Medium.

Zentrifugieren Sie die gewaschenen Zellen erneut bei 220 g für vier Minuten bei 18 bis 22 Grad Celsius und resuspendieren Sie die Zellen in serumfreiem RPMI-1640-Medium. Nach Einstellen der Zellkonzentration auf zwei mal zehn hoch sechs Zellen pro Milliliter werden 0,5 Milliliter der Suspension in jede Vertiefung einer mit Polylysin vorbeschichteten 12-Well-Platte eingepflanzt. Fügen Sie 100 Mikroliter serumfreies RPMI-1640-Medium mit oder ohne 300 nanomolare Phorbol-12-Myristat-13-acetat oder PMA hinzu.

Kultivieren Sie die Zellen 30 Minuten lang. Entfernen Sie als Nächstes das Medium aus den Vertiefungen. Waschen Sie die Zellen einmal mit serumfreiem RPMI-1640-Medium und ersetzen Sie es durch serumfreies RPMI-1640, das entweder null oder 20 Mikrogramm pro Milliliter Lipoprotein niedriger Dichte enthält.

Kultivieren Sie die Zellen zwei Stunden lang. Sammeln Sie das Nährmedium aus jeder Vertiefung in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie es drei Minuten lang bei 700 g bei 18 bis 22 Grad Celsius, um Zelltrümmer zu entfernen. Entnehmen Sie zur Stimulation die humane Aorten-Endothelzellkultur, ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch 0,5 Milliliter frisches Kulturmedium und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang.

Geben Sie schließlich 167 Mikroliter des Kulturmediums aus neutrophilenähnlichen Zellen, die extrazelluläre Neutrophilenfallen und LDL enthalten, in menschliche Aorten-Endothelzellschalen. Die Stimulation von humanen Aorten-Endothelzellen mit neutrophilen extrazellulären Fallen führte zu dosisabhängigen morphologischen Veränderungen von einer kopfsteinpflasterartigen zu einer länglichen Form. Morphologische Veränderungen in humanen Aorten-Endothelzellen wurden verstärkt, wenn sie mit LDL-induzierten extrazellulären Neutrophilenfallen stimuliert wurden, wobei die sichtbare Verlängerung bereits nach sechs Stunden sichtbar war.