Quantifizierung der endothelialen Fettsäureaufnahme mit Hilfe von fluoreszierenden Fettsäureanaloga

Blutübertragene Nährstoffe wie Fettsäuren müssen eine kapillare Endothelbarriere durchqueren, um über wenig verstandene Mechanismen in das Stoffwechselgewebe einzudringen. Die Klärung dieser Prozesse könnte neue therapeutische Ziele zur Behandlung von Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes offenbaren. Wir fanden also heraus, dass sowohl Skalpellmuskel als auch Fettgewebe die Aufnahme und den Transport von Endothellipiden über parakrine Metaboliten regulieren, die teilweise auch vom endokrinen System gesteuert werden.

Außerdem haben wir festgestellt, dass mitochondriales ATP unerwartet zur Fettaufnahme im Endohel beiträgt, obwohl sie bekannt von glykolytischem ATP angewiesen sind. Anhand des in diesem Protokoll beschriebenen Tests planen wir, die molekularen Mechanismen, die der Aufnahme und dem Transport von endothelialen Fettsäuren zugrunde liegen, tiefer zu untersuchen, einschließlich der Regulierung durch anderes Gewebe. Zu Beginn bereiten Sie eine 0,1%ige Gelatinelösung vor, indem Sie 25 Milliliter 2%-Gelatinebestand zu 475 Millilitern PBS hinzufügen.

Die Gelatinelösung gründlich mischen und mit einem 0,2-Mikrometer-Vakuumfilter oder einem Autoklaven filtersterilisieren. Mit einer Pipette geben Sie 100 Mikroliter der 0,1%-Gelatinelösung in jede Mulde einer schwarzen, klaren unteren 96-Well-Platte. Stellen Sie die Platte mindestens 30 Minuten oder über Nacht in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation wird die zusätzliche Gelatinelösung von der vorbeschichteten 96-Well-Platte entfernt. Waschen Sie den Teller einmal mit PBS. Dann pipettiert man 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Quelle mit einer Aussaatdichte, die es ermöglicht, dass die Zellen bis zum nächsten Tag zusammenkommen.

Bereiten Sie 20 millimolare Lösungen von 3-Hydroxyisobutyrat und Laktat als positive Kontrollmittel vor. Für die negative Kontrolle verwenden Sie ein mikromolares Niclosamid. Dann pipettieren Sie die Lösungen in eine separate 96-Well-Platte.

Waschen Sie die Endothelzellen einmal mit vorgewärmtem bivalentem PBS und pipetteren Sie sie in einem steilen Winkel, um eine Störung der plattenierten Zellen zu vermeiden. Fügen Sie pro Bohr 50 Mikroliter des geeigneten Behandlungsreagens hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 oder 60 Minuten. Um den BODIPY-Fettsäure-BSA-Komplex herzustellen, mischen Sie eine 2-mikromolare BODIPY-Fettsäurelösung mit 1 mikromolaren fettsäurefreien BSA in PBS.

Die Mischung vor der Anwendung bei Zimmertemperatur im Dunkeln 10 Minuten inkubieren lassen. Als Nächstes fügen Sie 50 Mikroliter des vorbereiteten BODIPY-Fettsäure-BSA-Komplexes zu jedem gut behandelten Bestandteil hinzu und inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie eine 1-mikromolare Lösung aus fettsäurefreiem BSA in PBS als Waschpuffer vor und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius vor.

Entfernen Sie den BODIPY-Fettsäure-BSA-Komplex aus den Brunnen und waschen Sie die gesamte Platte zweimal mit 50 Mikrolitern vorgewärmtem Waschpuffer, wobei jeder Wasch 1,5 Minuten lang durchgeführt wird. Anschließend fügen Sie jedem Brunnen 50 Mikroliter 0,08 % Trypanblau hinzu, um die extrazelluläre Fluoreszenz zu dämpfen. Mit einem Mikroplattenleser wird sofort die intrazelluläre Fluoreszenz gemessen.

Nachdem Sie die Trypan-Blue-Lösung aus den Brunnen entfernt haben, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS. Gib pro Milliliter Hoechst-Farbstoff, verdünnt in 10%-Medien, zu jedem Brunnen hinzu. Die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius ausbrüten.

Wasche den Teller dann einmal mit PBS, um überschüssige Farbe zu entfernen. Danach wird frisches PBS in jedes Bohrloch gegeben und die Hoechst-Fluoreszenz mit einem Mikroplattenleser gemessen. In sowohl HUVEC- als auch EA.hy926-Zellen stieg das intrazelluläre BODIPY-C12-Signal signifikant mit höheren BODIPY-Fettsäurekonzentrationen nach einer Minute, fünf Minuten und zehn Minuten Inkubation.

Eine einstündige Laktatbehandlung erhöhte die BODIPY-C12-Aufnahme dosisabhängig bei 5 Millimolaren und 20 Millimolaren Konzentrationen. Die Behandlung mit 3-Hydroxyisobutyrat verbesserte zudem die BODIPY-C12-Aufnahme in dosisabhängiger Weise, wobei die höchste Aufnahme bei 20 Millimolar erreicht wurde. Die Behandlung mit 1 Mikromolar-Niclosamid über 30 Minuten führte zu einer signifikanten Reduktion der BODIPY-C12-Aufnahme im Vergleich zur unbehandelten DMSO-Kontrolle.

Nach einer fünfminütigen Inkubation mit BODIPY-C16 in HUVEC erhöhte die Laktatbehandlung mit 10 Millimolar und 20 Millimolar die Aufnahme maßgeblich dosisabhängig. Die Behandlung mit einem mikromolaren Niclosamid verringerte die BODIPY-C16-Aufnahme signifikant im Vergleich zur unbehandelten DMSO-Kontrolle.