Eine benutzerfreundliche und leistungsstarke R-Analyse von großräumigen Datensätzen

Wir wollen die molekulare Grundlage verstehen, wie Pflanzen sich gegen ihre Krankheitserreger verteidigen, und dieses Wissen letztlich nutzen, um die Pflanzengesundheit und den Ernteertrag zu verbessern. Große Datensätze können in einem biologischen Bereich relativ leicht generiert werden, jedoch kann die zeitnahe Analyse solcher größeren Datensätze eine Herausforderung sein. Zu Beginn geben Sie die Samen in ein Mikrozentrifugenrohr mit drei Löchern oben und legen Sie das Rohr in ein Glasglockenglas.

Anschließend erzeugen Sie Bleichdampf, indem Sie drei Milliliter 36 % Salzsäure zu 100 Millilitern Haushaltsbleichmittel in einem Becher in einem Dampfzug hinzufügen. Stellen Sie das Becherglas in das Glasglockenglas und lassen Sie es drei Stunden in einer chemischen Abzugshaube stehen. Nach der Sterilisation werden die Samen mit einer sterilen Glas-Pasteur-Pipette auf Murashige- und Skoog-Mediumplatten mit 0,5 % Saccharose und 0,8 % Schnecke in einem laminaren Flussschrank angebracht.

Stellen Sie die angelegten und versiegelten Murashige- und Skoog-Platten zwei Tage lang in eine Umgebung mit vier Grad Celsius ein, bevor Sie sie in eine Gewebekulturkammer bringen, die auf einen 12-Stunden-Licht- und 12-Stunden-Dunkelzyklus eingestellt ist. Dann werden die Setzlinge auf eine 96-Brunnen-Platte übertragen und darauf geachtet, dass jede Bohrung 180 Mikroliter Prüfmedium enthält. Decken Sie die Platte mit klarer Folie ab und stechen Sie pro Brunnen zwei Löcher zur Belüftung.

Stellen Sie die Platten für einen Tag unter 12-Stunden-Licht und 12-Stunden-Dunkelzyklen, gefolgt von einem Tag unter 24 Stunden konstantem Licht. Fügen Sie jedem Brunnen Behandlungen oder eine Probelösung hinzu. Anschließend werden Lumineszenzwerte unter konstanten Lichtverhältnissen mit der Verstärkung der Emissionsfilterlinse auf 3.600 und der Messintervallzeit auf eine Sekunde erfasst und die Datenerfassung begonnen.

Am Ende der Lumineszenzaufnahme machen Sie ein Foto der 96-Well-Platte, um das Wachstum der Setzlinge zu dokumentieren. Beobachten Sie die Datenkurven aus dem Lumineszenzassay, um die Behandlungskonsistenz zu bestätigen, und speichern Sie die Rohlumineszenzdaten als CSV-Datei für die nachgelagerte R-Analyse mit der Save-as-Funktion in der Datenanalysesoftware des Plattenlesers. Nach der Installation der RStudio-Software und der erforderlichen algorithmischen Pakete wählen Sie das Arbeitsverzeichnis aus, in dem die Eingabedatei gespeichert ist, das auch als Ausgabeordner für Ergebnisse dient.

Wählen Sie dann die korrekt formatierte CSV-Eingabedatei aus. Stellen Sie sicher, dass die oberste Reihe Zeitpunkte enthält und die erste Spalte die einzelnen Probenpositionen auf der 96-Well-Platte auflistet. Benennen Sie die Proben und Behandlungen nach dem 96-Well-Plattenlayout und stellen Sie sicher, dass das Design entweder acht Replikate pro Behandlung mit bis zu 12 Behandlungen oder 12 Replikate pro Behandlung mit bis zu acht Behandlungen umfasst.

Wenn Zeilen oder Spalten leer sind, weisen Namen wie Leer1, Leer2 und so weiter der Behandlungslabelliste zu. Dann geben Sie die relative Startzeit des Luziferase-Tests anhand des Zeitpunkts des Lichteinbruchs in der Kammer an. Passen Sie den Abschnitt User Input II an, um spezifische Analysebedürfnisse zu erfüllen.

Beziehen Sie die Graphengenerierung für Lumineszenzkurven sowie für Perioden-, Phasen- und Amplitudenvergleiche über Genotypen und Behandlungen hinweg. Verwenden Sie den ANOVA-Test zusammen mit Tukeys Honest Significant Difference Test, um Behandlungen basierend auf Periode, Phase und Amplitude zu vergleichen. Wählen Sie eine Kontrollbehandlung für das Analyseergebnis oder lassen Sie das Kontrollfeld leer, um alle Behandlungen paarweise zu vergleichen.

Optional kann man die Analyseausgabedateien nummerieren, um die Referenz und Organisation zu erleichtern. Verwenden Sie nun einen T-Test, um Behandlungen anhand ihrer Periode, Phase und Amplitude zu vergleichen. Entscheiden Sie, ob der t-Test als paarweiser Vergleich durchgeführt werden soll, und geben Sie gegebenenfalls an, ob die Daten gepaart sind.

Entscheiden Sie, ob Sie die Zeitpunkte im Datensatz abrunden. Wenn sich die Zeitwerte nur um wenige Minuten unterscheiden, runden Sie sie auf die nächstgelegene Stunde ab, bevor Sie mit der Analyse fortfahren. Stellen Sie nun das Eingabeformat für die Bohrlochidentifikation ein, basierend darauf, wie der Kennzeichenleser die Daten exportiert.

Wählen Sie zwischen dem Standardformat, bei dem die Bohrlöcher nach A1, A2, A3 usw. aufgeführt sind, oder dem alternativen Format, bei dem die Bohrlöcher nach A1, B1, C1 usw. aufgeführt sind. Führen Sie dann die Luciferase-Datenanalyse durch, indem Sie auf den Quell-Button in der oberen rechten Ecke der RStudio-Konsole klicken. Sehen Sie sich die Analyseausgabe im vorgesehenen Ausgabeordner an, der Dokumente und Unterordner enthält, die die gemittelten Perioden-, Phasen- und Amplitudenstatistiken für jeden Genotyp und jede Behandlung zusammenfassen.

Mit einer Biopsiestiche werden vier Millimeter große Blattscheiben vom vierten bis siebten Blatt 25 Tage alter Pflanzen abgeschnitten. Lassen Sie die Blattscheiben mit der behaarten Seite nach oben in 100 Mikrolitern sterilem Wasser in einer 96-Well-Platte schwimmen. Decken Sie die 96-Well-Platte mit sauberem Alufolie ab und legen Sie sie über Nacht in eine helle und dunkle Wachstumskammer.

Dann entferne die Platte und ersetze steriles Wasser durch 100 Mikroliter Luminollösung. Beginnen Sie sofort damit, jede Minute 40 bis 60 Minuten Lumineszenz aufzuzeichnen. Nachdem Sie die erforderlichen RStudio-Pakete heruntergeladen haben, wählen Sie das Arbeitsverzeichnis aus.

Wählen Sie die Eingabedatei aus und stellen Sie sicher, dass es sich um eine korrekt formatierte CSV-Datei handelt. Die oberste Reihe sollte Zeitreihendaten enthalten, und die erste Spalte sollte die Stichprobenpositionen auf einer 96-Well-Platte enthalten. Nennen Sie die Proben und Behandlungen entsprechend dem zuvor beschriebenen Plattenlayout.

Beschrifte leere Wells explizit als Empty1, Empty2 und so weiter. Verwenden Sie den ANOVA-Test mit Tukeys ehrlicher signifikanter Unterschied, um die Gesamtlumineszenzsummen zwischen den Behandlungen zu vergleichen. Verwenden Sie einen zweiseitigen T-Test, wenn Sie Daten von nur zwei Behandlungen gleichzeitig vergleichen.

Erstellen Sie grafische Ausgaben, einschließlich Fluoreszenzkurven und eines Balkendiagramms, das die gesamte Lumineszenzsumme über die Behandlungen hinweg zeigt. Fügen Sie entweder die Standardabweichung oder den Standardfehler des Mittelwerts zu den dargestellten Balken hinzu. Passen Sie das Eingabeleseformat entsprechend an, wie der Kennzeichenleser Gut-Kennungen ausgibt.

Wählen Sie zwischen Standardlisten nach A1, A2, A3 oder vertikaler Listung nach A1, B1 C1.To führen Sie die Analyse durch, klicken Sie auf die Schaltfläche Quelle, die sich oben rechts in der RStudio-Konsole befindet. Sehen Sie sich die Ausgabe im generierten Ordner an, der mehrere Dokumente und Unterordner enthält, die die vollständige Analyse zusammenfassen. Der Luciferase-Test wurde mit einer transgenen Linie durchgeführt, die den CCA1-Luciferase-Reporter ausdrückte, und sieben unabhängig transformierte transgene Linien, die den GRP7-Luciferase-Reporter ausdrückten.

Die Leuchtspuren dieser Pflanzen wurden über 168 Stunden gemessen. Mit der R-Methode wurden berechnete Taktparameter für den CCA1-Luciferase-Reporter mit einer Amplitude von 3.000 relativen Lumineszenzeinheiten pro Sekunde und Setzling, einem Zeitraum von 23,5 Stunden und einer Phase von 3,5 Stunden erhalten. Alle pGRP7-Luciferaselinien zeigten ähnliche Perioden- und Phasenwerte, variierten jedoch in der Amplitude.

Die Phase der pGRP7-Luziferase beträgt 24,2 Stunden, während die Phase 12 Stunden beträgt. Um die R-Analyse weiter zu validieren, wurde derselbe Datensatz mit BioDare2, einer kostenlosen Online-Plattform für zirkadiane Datenanalyse acht, erneut analysiert, und ähnliche Ergebnisse wurden erzielt. Die circadianen Daten, die mit U2-OS-Zellen erzeugt wurden, die den Per2dLuc-Reporter ausdrückten, wurden mit der R-Methode neu analysiert.

Die Kontrollgruppe zeigte eine Amplitude von 184,8 relativen Lumineszenzeinheiten, eine Periode von 23,3 Stunden und eine Phase von 2,8 Stunden. Der Knockdown von CRY2, aber nicht von PSMD4 und PSMD7, beeinflusste die zirkadianen Parameter, Amplitude, Phase und Periode signifikant. Diese Ergebnisse stimmten mit den veröffentlichten Ergebnissen überein.

Unsere Forschung hat gezeigt, dass die zirkadiane Uhr wichtig für die geplante Abwehr gegen Krankheitserreger ist. Wir haben das hier beschriebene Protokoll routinemäßig verwendet, um groß angelegte Zeitreihendatensätze sowohl aus Uhr- als auch Verteidigungstests zu analysieren. Unser Protokoll mit R-Skripten in RStudio bietet Forschern, die mit groß angelegten Zeitreihendaten arbeiten, ein benutzerfreundliches und praktisches Werkzeug.

Unser Protokoll ist einfach zu bedienen, bietet mehrere statistische Optionen und ermöglicht es Anfängern, die keine Vorkenntnisse in R-Technik oder Programmierkenntnisse haben, es zu nutzen.