Name: Vor-Ort-DNA-Nachweis von Trypanosomatiden-Parasiten und Nosema ceranae durch alkalische Lyse gekoppelt mit RPA/CRISPR/Cas12a-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Erfahren Sie die schnelle DNA-Detektion von Bienenpathogenen wie Lotmaria passim und Nosema ceranae mittels alkalischer Lyse gekoppelt mit RPA und CRISPR/Cas12a. Diese Methode ermöglicht vor-Ort-Diagnostik ohne aufwendige Laborinfrastruktur.

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<ol><li>Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+declines+driven+by+combined+stress+from+parasites%2C+pesticides%2C+and+lack+of+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers.</a> Science. 347 (6229), 1255957(2015).</li>
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<li>Peng, R., Lu, Z., Liu, M., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+for+rapid+and+multiplex+detection+of+respiratory+infectious+viruses+based+on+centrifugal+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-RPA-assisted CRISPR/Cas12a for rapid and multiplex detection of respiratory infectious viruses based on centrifugal microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 399, 134838(2024).</li>
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<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+all-in-one+RPA-Cas12a+strategy+with+de+novo+autodesigner+and+its+application+in+on-site+ultrasensitive+detection+of+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses.</a> Biosens Bioelectron. 239, 115609(2023).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6641">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68871">10.3791/68874</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68874">On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

<table><tbody><tr><td>0,2 mL DNAse- und RNAse-freie Eppendorf-Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>MTC-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL DNAse- und RNAse-freie Eppendorf-Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>MTC-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L gefilterte Spitzen mit geringer Retention</td><td>LabClinics</td><td>Artikel-Nr.: 5-063-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L gefilterte Spitzen mit geringer Retention</td><td>LabClinics</td><td>5-120-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L gefilterte Spitzen mit geringer Retention</td><td>LabClinics</td><td>5-203-P4-0</td><td></td></tr><tr><td>BH-200 Serie Stuart Trockenblockheizung</td><td>Cole-Parmer</td><td>Artikel-Nr.: EW-36610-00</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>Ambicon</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>EnGen LBA Cas12a (CPF1)</td><td>Neuengland Biolabore</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen-Stößel</td><td>Fisherbrand</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>Milenia GenLine HybriDetect</td><td>Milenia</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>RPA-Bausatz TwistAmp Liquid Basic</td><td>TwistAmp</td><td>&nbsp; TALQBAS01</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell-Klingen</td><td>Swann-Morton</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Einzelne Chanel Pipette PIPETMAN P1000L Mikropipette Metallauswurf</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Einzelne Chanel Pipette PIPETMAN P100L Mikropipette Metallauswurf</td><td>Gilson</td><td>F144057M</td><td></td></tr><tr><td>Einzelne Chanel Pipette PIPETMAN P10L Mikropipette Metallauswurf</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhypochlorit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Touch-Echtzeit-PCR-Nachweissystem</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. T1503</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Liquid Basic</td><td>Verdrehen</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

vor-ort-dna-nachweis von trypanosomatiden-parasiten und nosema ceranae durch alkalische lyse gekoppelt mit rpa/crispr/cas12a-system

On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

Hier haben wir eine schnelle Vor-Ort-Methode beschrieben, bei der die alkalische Lyse von Arbeiterbienenabdomen in Verbindung mit RPA-Amplifikation und CRISPR/Cas12a-basierter Nachweis durch Fluoreszenz- und/oder Lateral-Flow-Ansätze verwendet wird. Das Schema des vollständigen Arbeitsablaufs ist in Abbildung 3 dargestellt, und das Schema der alkalischen HotSHOT-Lyse des Abdomens von Arbeiterbienen ist in Abbildung 4 dargestellt. Repräsentative Ergebnisse des RPA/CRISPR/Cas12a-Assays sind in Abbildung 5 dargestellt. Zum Nachweis von L. passim und N. ceranae wurde ein Thermocycler verwendet, um die relativen Fluoreszenzeinheiten (RFUs) mit einer FAM-markierten Sonde zu quantifizieren (Abbildung 4A). Die RPA-Reaktionen wurden mit 10 ng DNA durchgeführt, und die Fluoreszenzdaten wurden in einem Diagramm dargestellt (Abbildung 4B). In der letzten Phase des Assays wurden die Proben in konischen Röhrchen mit einem Gel-Imaging-System fotografiert (Abbildung 4C). Für den Nachweis mit einer Biotin-markierten Sonde wurden die Proben in einem Thermoblock inkubiert (Abbildung 4A); Die Detektionslösung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt und auf einen Lateral-Flow-Streifen aufgetragen (Abbildung 4B, C). Die Methode führte zu einem erfolgreichen Nachweis beider Honigbienen-Erreger.
Um die Effizienz von RPA-Reaktionen zu bestimmen, haben wir diese Methode mit der Standard-qPCR verglichen, bei der DNA verwendet wurde, die von Honigbienen mit dem referenzierten Kit aufgereinigt wurde (siehe Materialtabelle). Insgesamt wurden 32 Bienenproben mit Primern getestet, die auf das β-Tubulin-Gen von L. passim abzielten, und dann durch CRISPR/Cas12a-Transspaltung von Fluoreszenzsonden nachgewiesen. Bemerkenswert ist, dass 12 Proben durch qPCR positiv waren, während RPA/CRISPR/Cas12a L. passim in 16 Proben nachweiste (Abbildung 5A). Dies deutet darauf hin, dass die Reaktionsleistung von RPA empfindlicher ist als die PCR, da es sich um die Goldstandard-DNA-Amplifikationsmethode handelt.
Ebenso haben wir die Nachweisgrenze (LOD) für qPCR und RPA gekoppelt an den CRISPR/Cas12a-Nachweis für L. passim-DNA als Erregermodell unter Verwendung von seriellen Verdünnungen von L. passim-DNA im Bereich von 66 ng bis 6 fg bestimmt. Bei der qPCR wurden nur 6 pg nachgewiesen, was etwa 96 Parasiten entspricht (Abbildung 5B). Im Vergleich dazu entsprach die LOD für RPA 96 Parasiten (Abbildung 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Allgemeiner Ablauf der alkalischen HotSHOT-Lyse in Verbindung mit RPA-Amplifikation und Cas12-Nachweismethoden bei Honigbienen. Abkürzungen: RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas = CRISPR-assoziiertes Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Verarbeitung der amplifikationsbereiten Zelllyse mit HotSHOT-Puffer. (A) Schneiden Sie den Bauch der Honigbiene mit einem Skalpell ab und legen Sie ihn in ein Zentrifugenröhrchen; (B) mit einem Stößel eine Mazeration mit 400 μl HotShot durchführen; (C) auf einem Thermoblock bei 95 °C für 10 min inkubieren; und (D) neutralisieren mit 400 μl 40 mM Tris-HCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Allgemeiner Arbeitsablauf für die Herstellung von Cas12a-Enzym und FAM- und Biotin-markierten Reportersondenlösungen. Abkürzungen: DEPC-Wasser = Diethyl Pyrocarbonat-behandeltes Wasser; crRNA= RNA CRISPR; Cas12 = Typ des CRISPR-assoziierten Proteins. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Nachweis von Lotmaria passim und Nosema ceranae mittels der CRISPR/Cas12a-Methode mit FAM- und Biotin-Sonden. Für die FAM-Detektion werden (A) Proben in einem Thermocycler inkubiert; (B) die relativen Fluoreszenzeinheiten (RFUs) von L. passim und N. ceranae; (C) Visualisierung der gleichen Proben unter einem Fotodokumentationssystem. Bei Biotin-Tests (a) eine Probe, die in einem Thermoblock inkubiert; b) die Proben wurden in einem Immunstreifen aus dem Kit hinzugefügt (siehe Materialtabelle); c) die Ergebnisse nach der Inkubation. Abkürzungen: LP= Lotmaria passim; NC= Nosema ceranae; NTC= keine Vorlagensteuerung; RFU: relative Fluoreszenzeinheiten <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Vergleich zwischen qPCR und RPA und Nachweisgrenze von Lotmaria passim. (A) Nachweis von L. passim in Honigbienenproben mittels konventioneller qPCR und RPA. (B) qPCR-Nachweisgrenze von L. passim mit SsoFast EvaGreen. (C) Nachweisgrenze von L. passim mittels CRISPR/Cas12a mit einer FAM-markierten Sonde; (D) Visualisierung des gleichen CRISPR/Cas12a-Nachweises (von C) unter einem Gel-Imaging-System (obere Reihe) und entsprechende Lateral-Flow-Ergebnisse unter Verwendung von CRISPR/Cas12a mit einer Biotin-markierten Sonde (untere Reihe). Abkürzungen: RPA = Rekombinase-Polymerase-Amplifikation; qPCR= quantitative Polymerase-Kettenreaktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenz</td>
			<td>Endkonzentration</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Reaktionspuffer</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>ca. 25 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>ca. 1,8 Mio.</td>
			<td>1,8 μL</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Basic E-Mix</td>
			<td>1x</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorwärts-Grundierung (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μl</td>
			<td>2,4 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umgekehrter Primer (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μl</td>
			<td>2,4 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Kernreaktionsmischung</td>
			<td>1x</td>
			<td>0,5 μl</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Wasser</td>
			<td>--</td>
			<td>0,7 μl</td>
			<td>3,7 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Mastermix-Komponenten für RPA mit Endvolumina von 10 μl und 50 μl und entsprechenden Arbeitskonzentrationen:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenz</td>
			<td>Endkonzentration</td>
			<td>10 μL Reaktion</td>
			<td>50 μL Reaktion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>280 mM MgOAc</td>
			<td>ca. 1,8 Mio.</td>
			<td>0,5 μl</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNS</td>
			<td>10-0,1 ng</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Volumen der Reagenzien, die pro Probe bei einer RPA-Reaktion zugegeben werden sollen
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenz</td>
			<td>[Lager]</td>
			<td>[endgültig]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas12a-Enzym</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nm</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-Sonde</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB-Puffer 10x</td>
			<td>10x</td>
			<td>1x</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA-Amplikon</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>32.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gesamt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 3: Konzentrationen von Reagenzien zur Herstellung einer Mischung aus FAM-Detektion mit der Methode CRISPR/Cas 12a. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenz</td>
			<td>[Lager]</td>
			<td>[endgültig]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas12a-Enzym</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nm</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-Sonde</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>500 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB-Puffer 10x</td>
			<td>10-mal</td>
			<td>1-mal</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA-Amplikon</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gesamt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 4: Konzentrationen von Reagenzien zur Herstellung einer Mischung von Biotin-Detektion mit der CRISPR/Cas 12a-Methode.

Vor-Ort-DNA-Nachweis von Trypanosomatiden-Parasiten und Nosema ceranae durch alkalische Lyse gekoppelt mit RPA/CRISPR/Cas12a-System

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Um den schnellen und präzisen Nachweis von Acinetobacter baumannii zu ermöglichen, stellen wir ein Protokoll vor, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) in Verbindung mit der LbaCas12a-Endonuklease zur Identifizierung von A. baumannii-Infektionen verwendet.

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Assoziierte Chromosome-Trap zur Identifizierung weiträumige DNA-Wechselwirkungen

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Vor-Ort-DNA-Nachweis von Trypanosomatiden-Parasiten und Nosema ceranae durch alkalische Lyse gekoppelt mit RPA/CRISPR/Cas12a-System (Video) | JoVE Journal

Vor-Ort-DNA-Nachweis von Trypanosomatiden-Parasiten und Nosema ceranae durch alkalische Lyse gekoppelt mit RPA/CRISPR/Cas12a-System

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