Bewertung der Wirkung von SASP-Faktoren auf die Proliferation von Krebszellen anhand einer vergleichenden Analyse von drei verschiedenen Methoden

Seneszente Krebszellen sekretieren solche Faktoren aus, die benachbarte Zellen beeinflussen. Wir präsentieren drei In-vitro-Modelle, um SASP-gesteuerte Parakrin- und Juxtacrin-Effekte auf die HeLa-Zellproliferation zu untersuchen, Echtzeit-Impedanzüberwachung und lebendzellbasierte Bildgebung dynamische, kinetische und morphologische Analysen, die seneszente und mikro-umweltliche Parakrin-Effekte über traditionelle Endpunkt-Tests hinaus aufzeigen. Zu Beginn schalten Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem ein, bevor Sie die Zellbesetzung starten.

Starte RTCA Software Version 2.0. Klicken Sie auf die X-Notizen-Schaltfläche und geben Sie die experimentellen Details ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Planen" und fügen Sie alle 15 Minuten für 72 Stunden zwei Schritte hinzu, um den Hintergrund aufzuzeichnen und die Zellproliferation zu überwachen.

Wählen Sie den ersten Schritt und klicken Sie auf Play. Füge manuell 50 Mikroliter vollständiges Medium zu jedem Brunnen der e-Plate-Ansicht hinzu. Waschen Sie anschließend sowohl die seneszente als auch die nicht-seneszente HeLa-Zellen mit fünf Millilitern sterilem, vorgewärmtem PBS.

Nach dem Aspirieren geben Sie einen Milliliter vorgewärmtes 0,05%-Trypsin und inkubieren. Neutralisieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern antibiotika-supplementiertem vollständigem DMEM. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 G bei Raumtemperatur für 10 Minuten.

Nach dem Entsorgen des Supernatanten werden die Zellpellets in fünf Millilitern antibiotika-supplementiertem vollständigem DMEM wieder suspendiert. Nun werden nicht-seneszente HeLa-Zellen in jeden Brunnen einer E-Plate View in 100 Mikrolitern antibiotika-supplementiertem vollständigem DMEM gesaat. Platziere die e-Platten-Ansicht in der Wiege des Echtzeit-Zellanalysesystems, damit die Zellen sich an der Plattenoberfläche im Inkubator anheften können.

Wählen Sie den zweiten Schritt und klicken Sie auf Play, um mit der Impedanzmessung zu beginnen. Samenzellen in den E-Plate-Einsatzbrunnen mit 60 Mikrolitern antibiotika-supplementiertem Material vervollständigen DMEM unter drei verschiedenen experimentellen Setups. Halten Sie den E-Plate-Einsatz sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid zur Befestigung.

Klicken Sie nach sechs Stunden Zellaussaat auf Pause und aspirieren Sie dann vorsichtig das Kulturmedium aus jedem Brunnen der E-Plate-Ansicht, um Serum und nicht haftende Zellen zu entfernen. Wasche Brunnen zweimal mit vorgewärmtem PBS bei 37 Grad Celsius. Füge 140 Mikroliter serumfreies DMEM zu jedem Brunnen der e-Plate-Ansicht hinzu.

Entfernen Sie das Medium. Waschen Sie Brunnen mit E-Plate-Einsatz mit PBS und fügen Sie dann 60 Mikroliter serumfreies DMEM hinzu. Positioniere nun den E-Platten-Einsatz in die E-Plate-Ansicht.

Drücke vorsichtig hinunter, bis der Einsatz vollständig im Bohrloch eingezadelt ist. Fügen Sie die kombinierte Platte in das Echtzeit-Zellanalysesystem ein. Klicken Sie auf Play, um die Echtzeitüberwachung der Zellindexwerte im 15-Minuten-Intervall mit der Software fortzusetzen.

Normalisieren Sie die Zellindexwerte zu dem Zeitpunkt, an dem die E-Plate-Ansicht und der E-Plate-Einsatz kombiniert und in das Echtzeit-Zellanalysesystem eingefügt werden. Als Nächstes drücken Sie den Datenanalyse-Knopf, um die Proliferationsrate und -menge anhand der maximalen Zellindex- und Steigungsdaten aus dem Echtzeit-Zellanalysesystem zu berechnen. Anschließend analysieren Sie die Daten mit einem geeigneten statistischen Programm.

Aspiratiere das Kulturmedium von beiden Sechs-Well-Platten, die die seneszente und nicht-seneszente HeLa-Zellen enthalten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS bei 37 Grad Celsius, um Restreste von Serum und Zellresten zu entfernen. Geben Sie zwei Milliliter serumfreies, mit Antibiotika angereichertes DMEM-Medium in jedes Bohrloch und inkubieren Sie die Zellen dann in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 48 Stunden.

Sammeln Sie das konditionierte Medium aus jedem Brunnen in sterile Röhren in einem laminaren Sicherheitsschrank. Zentrifugieren Sie das gesammelte konditionierte Medium bei 1000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Zellreste zu entfernen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das klarisierte Supernatant zu erhalten. Anschließend wird das konditionierte Medium mit zwei-Milliliter-Ultrazentrifugalfiltereinheiten bei vier Grad Celsius 60 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert, um es auf 400 Mikroliter zu konzentrieren.

Verdünnen Sie das gewonnene Konzentrat mit frischem, serumfreiem Medium, um 1x, 2x und 3x konzentriertes konditioniertes Medium in sterilen Röhren in einer laminaren Sicherheitskabine herzustellen. Wenn die Zellen angeheftet sind, wird das Kulturmedium vorsichtig aus jedem Bohrloch der E-Plate-Ansicht aspiriert, um Serum und nicht haftende Zellen zu entfernen, und mit PBS gewaschen. Als Nächstes wurde 200 Mikroliter gesammeltes konditioniertes Material bei 37 Grad Celsius in jede Gruppe vorgeheizt.

Fügen Sie die E-Plate-Ansicht in das Echtzeit-Zellanalysesystem ein und klicken Sie auf Play, um die Echtzeitüberwachung der Zellindexwerte im 15-Minuten-Intervall für 48 Stunden fortzusetzen. Die Samenzelle werden auf einem Mikro-Objektträger unter drei Versuchsanlagen eingesetzt und bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Nach acht Stunden Anheftung werden die Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS bei 37 Grad Celsius gewaschen.

Fügen Sie jedem Brunnen 200 Mikroliter serumfreies Dulbeccos Modified Eagle's Medium hinzu. Schalten Sie den Temperaturregler 2002-2 ein und stellen Sie ihn auf 37 Grad Celsius ein. Schalten Sie den CO2-Controller 2000 ein und stellen Sie ihn auf 5 % Kohlendioxid ein.

Schalten Sie die Leuchtstoffröhrenlichtquelle ein. Stelle den Objektträger auf die Inkubationskammer auf der Bühne. Starte die Software am Computer.

Wählen Sie das 20x-Ziel. Fügen Sie den Phasenkontrastkanal und den Fluoreszenz-FITC-Kanal hinzu. Markiere mit dem Stage-Controller die Positionen für jeden Ort.

Stellen Sie das Zeitintervall auf 30 Minuten und die Aufnahmedauer auf 48 Stunden ein und beginnen Sie dann mit der Aufnahme. Zähle die positiven Zellen des grünen fluoreszierenden Proteins zu beiden Zeitpunkten und berechne den prozentualen Anstieg für die Analyse. Die Doxorubicin-Behandlung induzierte signifikant die zelluläre Seneszenz in HeLa-Zellen.

Die Quantifizierung von SA-beta-gal-positiven Zellen zeigte einen signifikant höheren Prozentsatz in der mit Doxorubicin-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Im ersten Ansatz zeigten nicht-seneszente HeLa-Zellen, die mit seneszenten HeLa-Zellen kokultiviert wurden, eine signifikant erhöhte Proliferationsrate und -kapazität im Vergleich zu Zellen, die mit nicht-seneszenten HeLa-Zellen kokultiviert wurden. Konditionierte Medien, abgeleitet aus seneszenten HeLa-Zellen, bei 2- und 3x-Konzentrationen, erhöhten die Proliferationsrate und Kapazität nicht-seneszenter HeLa-Zellen signifikant im Vergleich zu konditionierten Medien aus nicht-seneszenten Zellen.

Im dritten Ansatz zeigten GFP-positive HeLa-Zellen nach 48 Stunden Kokultur einen signifikant größeren Anstieg der Proliferation, wenn sie mit seneszenten HeLa-Zellen kokultiviert wurden, verglichen mit nicht-seneszenten Kokulturen oder nur GFP-Kontrollen.