Dissektion von kraniofazialem Gewebe von Zebrafischen nach Färbung mit Alcian Blue

Wir erforschen die Mechanismen, durch die der Gaumen von Zebrafischen im Laufe der Zeit wächst, sowohl anhand von fixierten Proben als auch mit Zeitraffer-Bildgebung von Embryonen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mittels Lichtblattmikroskopie. Unser Protokoll ist einfach und leicht zu befolgen. Es legt detaillierte Schritte zum Präparieren und Trennen der kraniofazialen Knorpel einer fünf Tage alten Zebrafischlarve fest.

Dieses Protokoll hat eine sorgfältige Charakterisierung der Gaumenform auf Gewebe- und Zellebene ermöglicht, was es uns letztendlich ermöglichte, die Wirkung von Kommentarantigenen auf die Gaumenmorphogenese zu bewerten. Besorgen Sie sich zunächst 20 bis 25 betäubte Zebrafischlarven und entfernen Sie das Betäubungsmittel, sobald sich die Larven nicht mehr bewegen. Geben Sie 1,5 Milliliter 4%-Paraformaldehyd in das Röhrchen und legen Sie die Probe zwei Stunden lang auf eine Wippe, die auf 60 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur eingestellt ist.

Entfernen Sie mit einer Pipette so viel Fixiermittel wie möglich aus dem Röhrchen. Geben Sie dann 1,5 Milliliter 50%iges Ethanol in die Probe und legen Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf 60 Umdrehungen pro Minute auf eine Wippe. Saugen Sie nun mit einer Pipette das Ethanol aus dem Röhrchen ab und geben Sie 1,5 Milliliter Alcianblau-Fleckenlösung in die Probe.

Inkubieren Sie die Larven in der Fleckenlösung für 18 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur und wiegen Sie dabei mit 60 Umdrehungen pro Minute. Entfernen Sie anschließend die Fleckenlösung mit einer Pipette und waschen Sie die Larven mit 1,5 Millilitern destilliertem Wasser für ein bis zwei Minuten auf einer Wippe bei Raumtemperatur. Geben Sie dann einen Milliliter Bleichlösung in die Probe und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, ohne die Röhrchen abzudecken.

Entfernen Sie mit einer Pipette die Bleichlösung aus der Probe und behandeln Sie die Probe mit den Gewebereinigungslösungen eins und zwei. Nachdem Sie Lösung zwei entfernt haben, geben Sie 1,5 bis zwei Milliliter Aufbewahrungslösung zur Probe. Aufgrund des Glyceringehalts ist zu beobachten, wie die gefärbten Proben innerhalb von 10 Minuten allmählich zu Boden sinken.

Legen Sie eine fleckige Larve auf der Seite in die mit Agarose beschichtete Petrischale. Kratzen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Eigelb vom Körper der Larven ab. Nach der Dotterentfernung die Larven in eine frische Petrischale umfüllen, um Störungen während der Dissektion zu vermeiden, und die Larven mit einer Pinzette in der Nähe des hinteren Teils des Kopfes halten.

Entfernen Sie mit einem anderen Paar vorsichtig die Augen, ohne die umgebenden kranialen Gesichtsstrukturen zu beschädigen. Während Sie die Larve halten, immer noch mit einer Pinzette, machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Gewebes dorsal zum Neuroschädel. Dann kneifen und ziehen Sie das Gehirn und das zugehörige Gewebe ab.

Trennen Sie als Nächstes den Kopf der Larven vom Rest des Körpers. Die resultierende Kopfregion sollte den neurologischen Schädel und den viszeralen Schädel umfassen, der noch an den vorderen und hinteren Enden befestigt ist. Durchtrennen Sie vorsichtig die beiden Verbindungspunkte zwischen dem Neurokranium und dem viszeralen Schädel mit einer Pinzette, um sie vollständig zu trennen.

Geben Sie zum Schluss ein oder zwei Tropfen 100%iges Glycerin auf einen sauberen Objektträger und übertragen Sie den präparierten Neuroschädel oder viszeralen Schädel auf den Objektträger. Legen Sie mit einer Pinzette vorsichtig einen Deckschirm auf das Gewebe, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, und versiegeln Sie den Deckglas mit Nagellack, bevor Sie es aufnehmen. Der präparierte Neuroschädel wies mehrere eindeutig gekennzeichnete Strukturen auf, darunter die Siebbeinplatte, die Trabekel und den Perikardknorpel, was eine detaillierte Strukturanalyse ermöglichte.

Der viszerale Schädel umfasste den Meckel-Knorpel und weitere Elemente wie das Palatoquadrat und die Basilikumbranchialknorpel. Die Alcianblau-Färbung fünf Tage nach der Befruchtung ermöglichte eine klare Visualisierung der Siebbalplatte. Die Breite und Länge der Siebbeinplatte waren mittels Bildanalyse konsistent messbar, und die Länge war signifikant größer als die Breite, und quantifizierte Daten von 15 Proben.

Die Fläche der Siebbeinplatte wurde aus den Bilddaten extrahiert und durch Quantifizierung mit klaren Grenzmarkierungen bestätigt. In der Siebbeinplatte wurden deutliche zelluläre Anordnungen mit quaderförmigen Zellen im medialen Bereich und Kolumerzellen in den lateralen Teilen beobachtet. Die Pappy-Färbung ermöglichte die Visualisierung einzelner Zellkerne innerhalb der Siebbeinplatte.