Name: Nachweis von aggregationsanfälligem Verhalten in mutierten P53 V157F Brustkrebszellen mittels Multipunkt-Thioflavin-T-Fluoreszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T14:57:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie aggregationsanfälliges p53 V157F in Brustkrebszellen mit Multipunkt-Thioflavin-T-Fluoreszenz nachweisen. Diese Methode verbessert die Genauigkeit bei der Detektion amyloidartiger Strukturen signifikant.

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<ol><li>Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awakening+the+%26%2334%3Bguardian+of+genome%26%2334%3B%3A+Reactivation+of+mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Awakening the &#34;guardian of genome&#34;: Reactivation of mutant p53.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+affordable+method+to+create+nonsense+mutation+clones+of+p53+for+studying+the+premature+termination+codon+readthrough+activity+of+ptc124%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124.</a> Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).</li>
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<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutant+p53+promotes+cell+growth+and+cancer+cell+metabolism+via+inhibition+of+ampk+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation.</a> Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).</li>
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<li>Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+p53+pathways%3A+Mechanisms%2C+structures%2C+and+advances+in+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).</li>
<li>Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+thioflavin+t+with+amyloid+fibrils%3A+Stoichiometry+and+affinity+of+dye+binding%2C+absorption+spectra+of+bound+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye.</a> J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).</li>
<li>Cai, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nampt+inhibitor+and+p73+activator+represses+p53+r175h+mutated+HNSCC+cell+proliferation+in+a+synergistic+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner.</a> Biomolecules. 12 (3), 438(2022).</li>
<li>Cai, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyllides+repress+gain-of-function+p53+mutated+hnscc+cell+proliferation+via+activation+of+p73+and+repression+of+p53+aggregation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).</li>
<li>Wu, K. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+anticancer+activity+of+hsp70+inhibitor+and+doxorubicin+in+gain-of-function+mutated+p53+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells.</a> Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).</li>
<li>Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+filter-trap+assay+for+amyloid+fibril+formation+kinetics+in+complex+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions.</a> ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).</li>
<li>Goldsbury, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+structure+and+assembly%3A+Insights+from+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).</li>
<li>Kayed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibril+specific%2C+conformation+dependent+antibodies+recognize+a+generic+epitope+common+to+amyloid+fibrils+and+fibrillar+oligomers+that+is+absent+in+prefibrillar+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers.</a> Mol Neurodegener. 2, 18(2007).</li>
<li>Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioflavin+t+as+an+amyloid+dye%3A+Fibril+quantification%2C+optimal+concentration+and+effect+on+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22R+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation.</a> R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).</li>
<li>Biancalana, M., Koide, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+thioflavin-t+binding+to+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils.</a> Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).</li>
<li>Yang-Hartwich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+protein+aggregation+promotes+platinum+resistance+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer.</a> Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).</li>
<li>Lei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+allosteric+mechanisms+of+the+lung-enriched+p53+mutants+v157f+and+r158l%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l.</a> Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
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<li>Yang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+protein-rich+clusters+host+the+nucleation+of+mutant+p53+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).</li>
<li>Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acidic+and+basic+ph+on+thioflavin+t+absorbance+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence.</a> Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).</li>
<li>Bom, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p53+core+domain+is+a+molten+globule+at+low+ph%3A+Functional+implications+of+a+partially+unfolded+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure.</a> J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).</li>
<li>Ano Bom, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p53+aggregates+into+prion-like+amyloid+oligomers+and+fibrils%3A+Implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer.</a> J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).</li>
<li>Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+is+essential+for+restoring+cellular+functions+of+temperature-sensitive+p53+mutant+protein+but+not+for+stabilization+and+activation+of+wild-type+p53%3A+Implications+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy.</a> J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).</li>
<li>Arsic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%94133p53%CE%B2+isoform+pro-invasive+activity+is+regulated+through+an+aggregation-dependent+mechanism+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).</li>
<li>Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta133p53alpha+and+delta160p53alpha+isoforms+of+the+tumor+suppressor+protein+p53+exert+dominant-negative+effect+primarily+by+co-aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation.</a> Elife. 14, RP106469(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>96-Brunnen-Kulturplatte</td><td>Ganz einfach</td><td>PC396-0100</td><td></td></tr><tr><td>Konterrutsche</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatisierter Zellenzähler</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Ganz einfach</td><td>CC704-0500</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfer Röhre</td><td>Ganz einfach</td><td>PC101-5000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AAT Bioquest</td><td>17530</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>735-0391&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blau</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis von aggregationsanfälligem verhalten in mutierten p53 v157f brustkrebszellen mittels multipunkt-thioflavin-t-fluoreszenz

Detection of Aggregation-Prone Behavior in Mutant P53 V157F Breast Cancer Cells Using Multipoint Thioflavin T Fluorescence

Nachweis von aggregationsanfälligem Verhalten in mutierten P53 V157F Brustkrebszellen mittels Multipunkt-Thioflavin-T-Fluoreszenz

The tumor suppressor p53, encoded by the TP53 gene, plays a central role in maintaining genomic stability. TP53 mutations, particularly hotspot variants, ...

detection-aggregation-prone-behavior-mutant-p53-v157f-breast-cancer

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In diesem Video demonstrieren wir einen zellbasierten Proteinaggregationsassay mit Proteasom-Inhibitoren, die die Proteasomaktivität blockieren und verhindern, dass fehlgefaltete, mutierte Proteine, die mit einer fluoreszierenden Markierung fusioniert sind, einen Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau durchlaufen, was zu ihrer Akkumulation im Zellzytoplasma führt. Anschließend werden die Proteinaggregate mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und quantifiziert.

Protein Aggregate Formation Assay: Eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Proteinaggregation in kultivierten Zellen nach Induktion durch Proteasom-Inhibitoren

Dieses Video zeigt die Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in genetisch veränderten Drosophila-Gehirnen. Das Gehirn wird fixiert, gewaschen und mit einem Antifading-Mittel behandelt, bevor es montiert wird. Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und quantifiziert, um die Übertragung mutierter Proteinaggregate zu beobachten.

Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in gentechnisch veränderten Drosophila-Gehirnen

Unmodifizierten und hyperphosphoryliertem Tau-Proteine ​​wurden in zwei In-vitro-Aggregationstests verwendet, um die Hyperphosphorylierung abhängige schnell Aggregationskinetik offenbaren. Diese Assays ebnen den Weg für weitere Bildschirme für Verbindungen, die die Neigung von hyperphosphoryliertem Tau modulieren kann zur Bildung von Fibrillen, die das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit zugrunde bilden.

In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Zell-zu-Zell-Transfer von Proteinaggregaten oder proteopathischen Seeds könnte dem Fortschreiten der Pathologie bei neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegen. In dieser Arbeit wird ein neuartiger FRET-Durchflusszytometrie-Assay beschrieben, der einen spezifischen und sensitiven Nachweis der Seeding-Aktivität aus rekombinanten oder biologischen Proben ermöglicht.

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Eine Kapillare-basierte Immunoassay mit einer kommerziellen Plattform zu Zielproteine von Gesamtprotein Vorbereitungen messen wird demonstriert. Darüber hinaus sind Assay Parametern Belichtungszeit, Proteinkonzentration und Antikörper-Verdünnung für ein Zellkultursystem Modell optimiert.

Verfahren und wichtige Optimierungsstrategien für eine automatisierte Kapillar elektrophoretischen basierende Immunoassay-Methode

Beweise sammeln, unterstützt die Idee, dass Pathogene Protein-Aggregate im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen verteilt zwischen den Zellen mit Prion-ähnliche Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine Methode, die ermöglicht die Visualisierung von Zelle zu Zelle ausbreiten von Prion-ähnlichen Aggregaten im Modellorganismus Drosophila Melanogaster.

Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster

Hier präsentieren wir eine neuartige Methode zur Bestimmung der verbindlichen Affinitäten im Gleichgewicht und in Lösung mit hoher Empfindlichkeit auf einer großen Skala. Dies verbessert die Quantitative Analyse der Transkription Faktor-DNA-Bindung. Die Methode basiert auf automatisierten Fluoreszenz Anisotropie Messungen in ein kontrolliertes Abgabesystem.

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

Wir präsentieren einen frei verfügbaren Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in bestimmten Zellkompartimenten in Fluoreszenzmikroskopiebildern. Dieser benutzerfreundliche Workflow wurde auf der Open-Source-Software Icy entwickelt und verwendet auch ImageJ-Funktionalitäten. Die Pipeline ist ohne Kenntnisse in der Bildanalyse erschwinglich.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verbesserung des Erfolgs des Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsnachweises bei Knochenmarkabstrichen von Patienten mit multiplem Myelom vor.

Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Knochenmarkabstrichen des Multiplen Myeloms

Erfahren Sie, wie Sie aggregationsanfälliges p53 V157F in Brustkrebszellen mit Multipunkt-Thioflavin-T-Fluoreszenz nachweisen. Diese Methode verbessert die Genauigkeit bei der Detektion amyloidartiger Strukturen signifikant.

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