CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum und die Erhaltung mutanter Linien
30. Dezember 2025
Dieser Artikel demonstriert die CRISPR-Cas9-vermittelte Genomtechnik im Steinernema hermaphroditum, einem entomopathogenen (EPN: insektenparasitären) Nematoden, und einem entstehenden genetischen Modell. Die beschriebene Technologie ist nützlich zur Erzeugung von Mutanten und ermöglicht die Aufklärung von Genfunktionen in der Nematodenbiologie, die für mutualistische und parasitäre Symbiose relevant sind.
Wir arbeiten an der Genetik der Symbiose der Nematodenbakterien, die landwirtschaftliche Anwendungen hat. Genetische Werkzeuge bei Xenorhabdus-Bakterien sind sehr gut entwickelt, aber die EPN-Genetik bleibt begrenzt und stützt sich hauptsächlich auf RNAi- und EMS-Screens. Zu Beginn sollten Sie Nematoden-Agarplatten erwerben, die mit Xenorhabdus griffiniae und Comamonas aquaticus besetzt sind.
Nehmen Sie Steinernema hermaphroditum-Nematoden auf die vorbereiteten NGM-Platten mit Xenorhabdus griffiniae. Inkubieren Sie sie bei 25 bis 28 Grad Celsius für optimales Wachstum. Am Abend vor der Mikroinjektion nehmen Sie J3-Hermaphroditen auf frische NGM-Agarplatten, die mit Xenorhabdus griffiniae besät sind.
Am Tag der Mikroinjektion wählen Sie junge erwachsene Hermaphroditen zur Injektion aus. Extrahiere die Zielgensequenz aus dem Steinernema-Hermaphroditum-Referenzgenom mit BlastP. Wählen Sie ein frühes kodierendes Exon, vorzugsweise das erste Exon, und geben Sie die Sequenz mit den Standardeinstellungen in CRISPRscan ein, um Kandidaten-CRISPR-RNAs zu erzeugen.
Sprengen Sie die besten CRISPR-RNAs gegen das Steinernema-Hermaphroditum-Genom, um sicherzustellen, dass es keine Off-Target-Übereinstimmungen gibt. Speichern Sie die ausgewählten CRISPR-RNAs und universelle transaktivierende CRISPR-RNAs jeweils bei 100 Mikromolaren in einem Duplexpuffer bei minus 80 Grad Celsius. Schmelze 2 % Agarose in Wasser mit einer Mikrowelle.
Übertragen Sie 50 Mikroliter der geschmolzenen Agarose auf ein Deckglas. Decken Sie es sofort mit einem zweiten Deckglas ab. Nach einer 20-minütigen Trocknungszeit entfernen Sie das obere Deckglas und beschriften Sie dann die Vorderseite des Agarose-Pads.
Lagern Sie die Agarose-Pads bei Zimmertemperatur für den langfristigen Gebrauch über Monate bis Jahre. Um die Nadeln für die Injektion vorzubereiten, ziehen Sie Quarzkapillaren an einem Laserfilamentzieher und bewahren Sie die Nadeln in einer Pipettenaufbewahrungsbox auf. Bereite frische Guide-RNA-Duplexe vor, indem du die ausgewählten crRNAs und universell transaktivierende CRISPR-RNAs in einem Eins-zu-eins-Verhältnis mischst.
Inkubieren Sie das Rohr bei 94 Grad Celsius für zwei Minuten, dann kühlen Sie auf Raumtemperatur ab, um Duplexe zu annealisieren. Setzen Sie die Injektionsmischung zusammen, indem Sie Cas9, Kaliumchlorid und die gRNA duplexen und inkubieren. Dreimal das PCR-Röhrchen zum Mischen bewegen, dann kurz 10 bis 15 Sekunden in einer Mini-Zentrifuge drehen.
Nach dem endgültigen Mischen bis zu einer Minute drehen, um den Inhalt zu sammeln. Als Nächstes verwenden Sie eine Microloader-Spitze, um ein bis zwei Mikroliter Injektionsmischung in die Nadel zu geben. Befestigen Sie die Nadel am Halter, brechen Sie die Spitze auf, indem Sie über doppelseitiges Klebeband unter Halocarbonöl ziehen.
Und die Größe der Öffnung mit der Reinigungsfunktion des Mikroinjektors zu testen. Lege einen kleinen Tropfen Halokarbonöl auf das 2%-Agarose-Pad. Mit einem Seziermikroskop und einem weichen Platindraht nehmen Sie einen jungen erwachsenen Hermaphroditen auf.
Wasche es in M9-Puffer, um die Bakterien zu entfernen. Übertragen Sie den Nematoden auf ein Agarose-Pad und legen Sie ihn in einen Tropfen mit Halokarbonöl. Benutze den weichen Platindraht, um den Nematoden vorsichtig zu bürsten, bis er bewegungsunfähig ist.
Montiere das Pad auf der Mikroinjektionsstufe. Suchen Sie einen Gonadenarm und stoßen Sie mit der Nadel in ihn. Verwenden Sie die Reinigungsfunktion des Injektors, um die Injektionsmischung mit 99 Pfund pro Quadratzoll zu liefern, bis der Gonadenfluss sichtbar ist und so den Zugang des Reagens zum Synzytium bestätigt.
Wenn zugänglich, versetzen Sie die Stufe neu und injizieren Sie den zweiten Gonadenarm auf ähnliche Weise. Unmittelbar nach der Injektion wird das injizierte Tier in ein bis zwei Mikroliter M9-Puffer auf dem Agarose-Pad wieder suspendiert. Benutze einen dünnen Platindraht, um den eingespritzten Wurm vom Pad zu nehmen, wasche dann das Öl mit M9-Puffer ab und hole es auf der mit Comamonas aquatica besäten NGM-Platte zurück.
Inkubieren Sie die Erholungsplatte über Nacht bei 25 Grad Celsius. Am nächsten Tag isoliert man jeden injizierten P0-Nematoden auf einzelne NGM-Platten, die mit Xenorhabdus griffiniae ausgesät sind. Zwei CRISPR-RNAs wurden entwickelt, die den Steinernema-Hermaphroditum-Homolog von unc-22 an zuvor veröffentlichten PAM-Stellen anvisieren.
Die Jerk-Analyse von Nikotin-Nematoden zeigte deutliche Bewegungsunterschiede zwischen unc-22-Mutanten und Wildtyp-Nematoden. Die Genotypisierung von zuckenden Nachkommen mittels PCR zeigte mehrere schwache Bänder an der Zielstelle sowohl für Pam 3 als auch Pam 5. Die Sequenzierung bestätigte Einfügungs- und Löschereignisse an der angevisierten unc-22-Stelle.
Mein Labor hat meine Postdoktorandenarbeit in der EPN-Genetik erweitert. CRISPR ist jetzt in drei Steinernema-Arten erhältlich. In diesem Protokoll etablierten wir eine effiziente Technik, um stabile, erbbare Mutanten mittels CRISPR-Cas9-Gen-Editierung zu erzeugen.
Mit stabiler CRISPR-Cas9-Geneditierung können wir die molekularen Mechanismen hinter der Steinernema-Xenorhabdus-Symbiose analysieren.
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Übersicht
In diesem Artikel wird die CRISPR-Cas9-vermittelte Genom-Editierung in Steinernema hermaphroditum, einem entomopathogenen Nematoden und einem aufstrebenden genetischen Modell, demonstriert. Die Technologie ist nützlich, um Mutanten zu erzeugen, die zur Aufklärung von Genfunktionen in der Nematodenbiologie im Zusammenhang mit mutualistischer und parasitischer Symbiose beitragen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genetik
- Mikrobiologie
- Entomologie
Hintergrund
- CRISPR-Cas9 ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Genomeditierung.
- Steinernema hermaphroditum dient als Modellorganismus zur Untersuchung von Nematoden.
- Das Verständnis von Genfunktionen kann Einblicke in symbiotische Beziehungen liefern.
- Entomopathogene Nematoden sind wichtig für die biologische Schädlingsbekämpfung.
Zweck der Studie
- Veranschaulichung der Anwendung von CRISPR-Cas9 bei Nematoden.
- Erzeugung von Mutanten zur funktionellen Genanalyse.
- Untersuchung der genetischen Grundlagen von mutualistischen und parasitären Interaktionen.
Verwendete Methoden
- CRISPR-Cas9-Genom-Editier-Techniken.
- Erzeugung und Charakterisierung von Mutanten.
- Analyse der Genfunktion in der Nematodenbiologie.
- Beurteilung von symbiotischen und parasitären Verhaltensweisen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Anwendung von CRISPR-Cas9 in Steinernema hermaphroditum.
- Erzeugung von lebensfähigen Mutanten mit veränderten Genfunktionen.
- Erkenntnisse über die genetischen Mechanismen, die symbiotischen Beziehungen zugrunde liegen.
- Mögliche Auswirkungen für Schädlingsbekämpfungsstrategien.
Schlussfolgerungen
- CRISPR-Cas9 ist effektiv für die Genom-Editierung bei Nematoden.
- Mutanten liefern wichtige Erkenntnisse über Genfunktionen.
- Diese Forschung vertieft das Verständnis der Nematodenbiologie und ihrer Anwendungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mithilfe der CRISPR-Cas9-basierten Genomeditierung in Steinernema hermaphroditum lassen sich die Mechanismen der Mutualität und Parasitie bei entomopathogenen Nematoden präzise genetisch untersuchen. Diese Plattform ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen und die mechanistische Absicherung im frühen Entdeckungsstadium mit direkten Auswirkungen für translationsorientierte Forschung in der landwirtschaftlichen und ökologischen Biotechnologie. Die Möglichkeit, stabile Mutantenlinien zu erzeugen und zu erhalten, beschleunigt forschungsgeleitete Entwicklungsarbeiten und die Selektion von Wirkstoffkandidaten für neuartige bioaktive Zielstrukturen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht gezielte Gen-Disruption, um die biologischen Signalwege, die nematoden-Wirt- und Nematoden-Bakterien-Interaktionen zugrunde liegen, aufzuklären.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Kandidatengenen, die an Mutualismus und Parasitismus beteiligt sind.
- Erleichtert die mechanistische Entschärfung von Risiken durch die Erzeugung beobachtbarer Phänotypen, die mit spezifischen genetischen Veränderungen verknüpft sind.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Auswahl und Priorisierung nachgeschalteter Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein genetisch handhabbares System zur Entwicklung und Validierung phänotypischer Assays bei Nematoden.
- Ermöglicht die reproduzierbare Erzeugung von Mutantenlinien für standardisierte Screening-Abläufe.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung der Genfunktion anhand beobachtbarer phänotypischer Ausprägungen.
- Vereinfacht die Assay-Entwicklung, indem die hermaphroditische Fortpflanzung zur schnellen Erzeugung homozygoter Linien genutzt wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung genetischer Manipulationen mit krankheitsrelevanten Modellen für die Forschung zur Bekämpfung landwirtschaftlicher Schädlinge.
- Ermöglicht die kontinuierliche Überführung von Genentdeckungen in die funktionelle Validierung in ökologisch relevanten Systemen.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung bioaktiver Zielstrukturen für translationale Anwendungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese CRISPR-Cas9-Plattform etabliert S. hermaphroditum als vielseitiges Modell für die frühe Forschung bis hin zur präklinischen Validierung in der Nematodenbiologie und Symbioseforschung.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen mittels gezielter Mutagenese und phänotypischer Validierung.
- Screening: Stellt reproduzierbare Mutantenlinien für die Standardisierung von Assays und quantitative Auswertungen bereit.
- Analysen: Ermöglicht die Messung phänotypischer Ergebnisse, wie beispielsweise des Zuckphänomens, um die Genfunktion unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Grundlagenforschung mit präklinischer Forschung in Modellen zur Schädlingsbekämpfung und Symbiose.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft ein wiederverwendbares genetisches Werkzeugset für die fortlaufende funktionelle Genomik bei EPNs und verwandten Arten.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Untersuchung von Genfunktionen.
- Operativer Wert: Bietet standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Arbeitsabläufe für genetische Modifikationen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffiziente Investitionen in der Forschung und Entwicklung neuer Zielstrukturen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung genetischer Zielstrukturen für landwirtschaftliche und ökologische Anwendungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikroinjektionstechniken und der CRISPR-Cas9-Genomeditierung.
- Benötigt Zugang zu Mikroinjektionsgeräten und Infrastruktur der Molekularbiologie.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg zur Pflege von Mutantenstämmen und zur phänotypischen Validierung.
- Die Übertragung auf andere EPN-Arten kann eine Optimierung des Protokolls erfordern.
- Die phänotypische Validierung hängt von beobachtbaren und quantifizierbaren Ergebnissen ab, wie beispielsweise dem Zuckungsphänotyp.
