High-Density-Lipoprotein-spezifischer Phospholipid-Efflux-Assay

Wir entwickelten einen Surrogat-Test zur Messung der HDL-vermittelten Entfernung von Plaque-Lipiden der Koronararterie zur Bewertung des Risikos für koronare Herzkrankheiten. Die aktuelle Herausforderung besteht darin, einen einfachen, schnellen und robusten HDL-Lipid-Influx-Test für Forschungs- und klinische Anwendungen zu entwickeln. Zu Beginn geben Sie alle benötigten Inhalte in ein Glas unter einer chemischen Dampfhaube und lassen Sie die Lipidmischung kurz vortexen, um die Lösungen zu mischen.

Trocknen Sie die Mischung in einem Glasröhrchen unter einem sanften Stickstoffstrahl für eine Stunde, um am Boden des Rohrs einen trockenen Lipidfilm zu bilden. Zur Beschichtung von Calciumsilikathydrat wird ein Wiegepapier-Kegel in das Glasrohr mit den getrockneten Lipiden eingefügt und 80 Milligramm Calciumsilikathydratpulver in das Rohr gegeben, wobei der Kegel das Pulver zur Basis leitet. Gib sofort 2 Milliliter Kochsalzlösung in die Tube und decke den oberen Teil mit Parafilm ab.

Vortexen Sie das Glasrohr von Hand, um den Großteil des Lipids von unten zu lösen. Setzen Sie das Glasrohr in ein Loch in einer Styroporplattform, das an einem Wirbel befestigt ist, und befestigen Sie das Rohr mit verstärktem Klebeband an der Wirbelplattform. Wirbel das Glasröhrchen für 10 Minuten in Vortex und stelle sicher, dass kein Lipid an der Wand des Röhrchens zurückbleibt.

Übertragen Sie den Inhalt des Glasröhrchens mit einer 1-Milliliter-Pipette auf ein 15-Milliliter-konisches Kunststoffrohr. Waschen Sie das Glasröhrchen mit 3 Millilitern Kochsalzlösung und übertragen Sie die Waschflüssigkeit in dasselbe 15-Milliliter-Rohr. Anschließend wird das 15-Milliliter-Kunststoffrohr mit lipidbeschichtetem Calciumsilikathydrat in eine Zentrifuge gelegt und bei 935 G für 2 Minuten bei 4 Grad Celsius gedreht.

Verwenden Sie eine lange und feine Pipettenspitze, um das Überlagerungsmittel zu aspirieren. Ausgehend vom oberen Rand des Supernatanten gleiten Sie die Pipettenspitze langsam an der Seite des Rohrs entlang, während Sie aspirieren. Kippen Sie das Rohr während der Aspiration leicht und lassen Sie etwa 200 Mikroliter Kochsalzlösung über dem Pellet liegen, um ein Stören zu vermeiden.

Dann gib Kochsalzlösung hinzu, um das Gesamtvolumen auf 5 Milliliter zu bringen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Entfernung des Supernatanten viermal. Nach der Endwäsche wird Kochsalzlösung hinzugefügt, um das Gesamtvolumen auf 2,5 Milliliter zu bringen. Pipette 75 Mikroliter Kochsalzlösung in jede Bohrung einer 0,3-Milliliter-96-Well-Platte entsprechend der Anzahl der für den Probensatz benötigten Bohrungen.

Vortisse das 15-Milliliter-Kunststoffrohr mit LC-CSH dreimal für jeweils 10 Sekunden. Mit einer einzigen Brunnenpipette wird 50 Mikroliter LC-CSH entlang der rechten Seite der salzhaltigen Bohrlöcher dosiert. Nach drei Brunnen wiederholen Sie das Vortex-Protokoll, bevor Sie in die nächsten drei Brunnen abgeben.

Drehen Sie die 96-Well-Platte um 180 Grad, sodass die linke Seite der Bohrungen nun nach rechts liegt. Pipettieren Sie 25 Mikroliter Plasma- oder Serumproben entlang der rechten Seite jedes Bohrlochs. Für die positiven Kontrollbrunnen fügen Sie 25 Mikroliter Referenz-Standard-Plasma oder Serum für menschliches normales lipidämisches Plasma oder Serum hinzu.

Als Nächstes versiegeln Sie die 96-Well-Platte fest mit einer Klebefolie und inkubieren Sie die versiegelte Platte im Dunkeln eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 1.200 Umdrehungen pro Minute in einem Thermomixer. Nach dem Inkubieren nehmen Sie die Platte aus dem Thermomixer und legen Sie sie auf Eis. Zentrifugiere die Platte zwei Minuten lang bei 935 G bei 4 Grad Celsius, um die Spenderpartikel zu pelletieren und die Transferreaktion zu stoppen.

Entfernen Sie nun vorsichtig die Klebefolie von der 96-Well-Platte, ohne das LC-CSH-Pellet zu stören. Übertragen Sie 50 Mikroliter Supernatant von der Reaktionsplatte in die Mulden einer schwarzen 96-Bohrloch-Polystyrolplatte mit flachem Boden mittels einer Mehrfachpipett. Füllen Sie ein Reservoir mit normaler Kochsalzlösung und fügen Sie jedem Brunnen 50 Mikroliter Kochsalzlösung hinzu.

Verwendung einer Mehrfachbrunnenpipette. Bereiten Sie 1 % Triton X-100 in einer 125-Milliliter-Plastikflasche aus Erlenmeyer vor. Füllen Sie ein Reservoir mit dem zubereiteten 1 % Triton X-100 und geben Sie 100 Mikroliter derselben Lösung bei Raumtemperatur in jedes Bohrloch.

Mischen Sie vorsichtig, indem Sie mit einer Mehrfach-Pipette vorsichtig zwei- bis dreimal nach oben und unten gehen und eventuelle Blasen mit Luft aus einer 3-Milliliter-Transferpipette platzen. Schließlich wird die Lissamin-Rhodamin-Fluoreszenz mit einem Fluorometer gemessen, mit Anregung bei 540 Nanometern und Emission bei 600 Nanometern. Eine Standardkurve wurde mit seriell verdünntem LRHPE, markiert mit LC-CSH, erzeugt und zeigte eine hochlineare Fluoreszenzantwort.

In der Plasmakonzentrationskurve-Studie wurden zunehmende Mengen an gesammeltem menschlichem Plasma in dreifachen Bohrlöchern zusammen mit salzhaltigen Kontrollen verteilt. Die Plasmadosis-Antwortkurve zeigte eine ausgezeichnete Linearität zwischen PE, Afflux und Plasmavolumen mit einer starken Korrelation im Bereich von 15–35 Mikrolitern. Unser einfaches und schnelles Protokoll, das das Risiko für einfallende Herz-Kreislauf-Erkrankungen vorhersagt, kann sowohl für Forschung als auch für klinische diagnostische Studien verwendet werden.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass unser Test die Rolle sowohl zellulärer als auch extrazellulärer Plaquelipide bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen aufklären kann.