Extraktion von Speichel, Hämolymphe, Speicheldrüsen und Mitteldarm aus einzelnen Zecken (Acari: Ixodidae)

Zu Beginn sammeln Sie Exemplare von Hyalomma dromedarii, Hyalomma rufipes, Amblyomma gemma und Rhipicephalus pulchellus von Kamelen. Sterilisiere die Zecke vorsichtig, indem du die ganze Zecke mit einem mit Bleichstoff getränkten Papiertuch und Ethanol abwische. Wenn die Zecke getrocknet ist, reinigen Sie die Mundpartien vorsichtig mit der Pinzette, indem Sie ein kleines Stück Papiertuch halten, das in 70 % Ethanol getränkt ist, und dann wieder trocknen.

Legen Sie die Zecke auf einen sauberen Glasträger unter dem Mikroskop, wobei die Bauchseite der Zecke nach oben zeigt, und halten Sie sie sicher zwischen Daumen und Zeigefinger. Injizieren Sie 20 Mikroliter einer Mischung, bestehend aus 2 % Pilocarpin-Hydrochlorid und PBS im Verhältnis 1:1, direkt hinter Coxa IV mit einer 31-Gauge-Spritze. Drehen Sie die Zecke so, dass die Rückenseite freiliegt, und fixieren Sie sie an einem Ende des Objektträgers mit transparentem Band. Lege ein kleines Stück ungiftigen Modellierton am gegenüberliegenden Ende des Objektträgers, um eine feste Fläche zur Unterstützung zu schaffen, und warte, bis die Zecke Speichel produziert.

Führen Sie die 0,5 bis 10 Mikroliter große Spitze zwischen die Palpen, um sicherzustellen, dass sie das Hypostom bedeckt. Saugen Sie den Speichel in die Pipettespitze. Um die Hämolymphe zu sammeln, schneiden Sie einem der Beine des Zecken ab.

Mit einer Skalpellklinge Größe 11 drücken Sie vorsichtig auf den Körper, wobei Sie darauf achten, nicht zu viel Druck auszuüben, da dies die Zecke oder innere Organe aufreißen und den Mitteldarminhalt freisetzen könnte. Sammeln Sie den Hämolymphtropfen mit einer Pipette auf, wobei eine 0,5- bis 10-Mikroliter-Spitze am Bein angebracht wird. Um die Zecke zu sezieren, erhitzen Sie zuerst Paraffinwachs mit einem Lötkolben, um eine geschmolzene Stelle in der Petrischale zu schaffen, wo die Zecke platziert wird.

Setzen Sie die Zecke in die geschmolzene Wachshöhle und stellen Sie sicher, dass der ventrale Teil des Körpers der Zecke untergetaucht und fest im Wachs gehalten wird. Schneiden Sie dann vorsichtig die Rückenkante des Körpers mit der Skalpellklinge ab und entfernen Sie die dorsale Abdeckung des Zeckenkörpers. Entfernen Sie die Speicheldrüsen, den Mitteldarm und andere Gewebe mit einer Pinzette.

Waschen Sie jede der extrahierten Gewebetypen gründlich in fünf Tropfen oder 50 Mikrolitern PBS in separaten Objektträgern. Die DNA-Konzentration war bei allen vier Zeckenarten in der Hämolymphe höher als im Speichel. Unter den vier Zeckenarten zeigte Rhipicephalus pulchellus hemolymph die höchste DNA-Konzentration im Vergleich zu den anderen.