Name: In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Lernen Sie Calcium-Bildgebung in olfaktorischen Neuronen von Drosophila melanogaster-Larven mit GLUture-Klebstoff. Diese kostengünstige Methode ermöglicht stabile in-vivo- und ex-vivo-Aufnahmen für neurophysiologische Studien.

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1. Vorbereitung von Drosophila-Larven des dritten Stadiums für die Kalziumbildgebung
<ol>
	<li>Halten Sie die Fliegen mit Standard-Fliegenfutter (siehe Materialtabelle) bei 25 °C, mit 50-60 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.</li>
	<li>Um das rote fluoreszierende Protein (RFP) für die Neuronenidentifikation und GCaMP6f (Kalziumindikator) in den Neuronen von Interesse ('X') zu exprimieren, kreuzen Sie jungfräuliche Weibchen der X-Gal4-Linie mit Männchen, die UAS-GCaMP6f und UAS-tdTomato22 tragen. HINWEIS: Für diese Studie wurde die Keystone-Gal4-Linie verwendet, um die Expression von tdTomato und GCaMP6f in einem einzelnen Paar inhibitorischer lokaler Neuronen (Keystone-LNs) im Larvengehirn zu steuern 18,19.</li>
	<li>Nachdem sich männliche und weibliche Fliegen 48 Stunden lang paaren und Eier legen konnten, werden die erwachsenen Fliegen in ein frisches Fläschchen umgefüllt.</li>
	<li>Extraktion der Larven des dritten Stadiums (ca. 120 Stunden nach der Eiablage), indem sie auf einer 15%igen Saccharoselösung schwimmen. Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um die schwimmenden Larven in ein 1.000-ml-Glasbecherglas zu übertragen.</li>
	<li>Waschen Sie die Larven 3-4x, indem Sie das Wasser im Becherglas jedes Mal durch 800 ml frisches destilliertes Wasser ersetzen. Lassen Sie die Larven 10 Minuten ruhen, bevor Sie mit dem Rest des Protokolls fortfahren.</li>
</ol>
2. Hungerprotokoll für Drosophila-Larven im dritten Stadium (wenn verhungerte vs. nicht verhungerte Bedingungen getestet werden)
<ol>
	<li>Bereiten Sie zwei Fütterungskammern vor, indem Sie ein kleines Quadrat Labortuch in 6 cm große Petrischalen geben. Für nicht verhungernde Bedingungen 350 μl 0,2 M Saccharoselösung hinzufügen; bei Hunger 350 μl destilliertes Wasser hinzufügen.</li>
	<li>Setzen Sie eine gleiche Anzahl gewaschener Larven in jede Futterkammer um. Lassen Sie die Larven 2 h lang bei Raumtemperatur mit Saccharose (nicht verhungert) oder destilliertem Wasser (ausgehungert) fressen.</li>
</ol>
3. In-vivo-Calcium-Bildgebung
HINWEIS: Alle Experimente mit dem Gewebekleber sollten unter Anwendung der üblichen Laborsicherheitspraktiken durchgeführt werden. Persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille oder Gesichtsschutz, ist erforderlich. Baumwollhandschuhe sollten aufgrund exothermer Reaktionen mit Cyanacrylat vermieden werden. Vermeiden Sie den Kontakt des Klebstoffs mit Haut, Augen oder Schleimhäuten. Im Falle einer Hautverklebung den Bereich in warmem Seifenwasser einweichen und vorsichtig abtrennen; Bei Exposition der Augen ≥5 Minuten lang mit lauwarmem Wasser spülen und sofort einen Arzt aufsuchen. Der Klebstoff sollte von offenen Flammen und hoher Hitze ferngehalten werden, da ausgehärteter Klebstoff beim Verbrennen störende Dämpfe freisetzen kann. Bewahren Sie den Klebstoff bei ≤30 °C, geschützt vor Feuchtigkeit und direkter Sonneneinstrahlung, in einem dicht verschlossenen Behälter auf, wenn er nicht verwendet wird.
<ol>
	<li>Bereiten Sie den Calcium-Imaging-Puffer mit der folgenden Zusammensetzung vor: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-Glucose 10 mM und HEPES 10 mM. Bei Nichtgebrauch bei 4 °C lagern. HINWEIS: Die modifizierte Kochsalzlösung mit 110 mM NaCl ist eine weithin akzeptierte Formulierung für die ZNS-Dissektion und -Bildgebung von Larven und fällt in den typischen Bereich, der in elektrophysiologischen und bildgebenden Studien verwendet wird (≈108-128 mM NaCl)23,24,25,26.</li>
	<li>Erstellen Sie auf einem 24 x 50 mm (1,5 mm dicken) Mikroskop-Deckglas eine Vertiefung mit Vaseline, die aus einer Spritze abgegeben wird.</li>
	<li>Geben Sie einen kleinen Tropfen topischen Gewebekleber (60 % 2-Octyl- und 40 % n-Butylcyanacrylat) in die Mitte des Deckglases. Verteilen Sie den Kleber mit einem Glasstab gleichmäßig zu einer dünnen, gleichmäßigen Schicht.</li>
	<li>Übertragen Sie vorsichtig eine einzelne Larve mit einer Bürste oder einem dünnen Draht auf den Kleber. Drücken Sie die Bauchseite der Larve vorsichtig auf den Kleber. Lassen Sie den Klebstoff trocknen und stellen Sie sicher, dass die Larve vollständig immobilisiert ist.</li>
	<li>Sobald die Larve immobilisiert ist, legen Sie das Deckglas auf den inversen Mikroskoptisch (Abbildung 1A).</li>
</ol>
4. Ex-vivo-Calcium-Bildgebung
<ol>
	<li>Bereiten Sie den Larvendissektionspuffer mit der folgenden Zusammensetzung vor: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-Glukose 10 mM und HEPES 10 mM. Bei Nichtgebrauch bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Präparieren Sie die Hirnsektionen, wie sie von Ishimoto und Sano10 beschrieben werden. Übertragen Sie eine einzelne Larve mit einer Bürste oder einem dünnen Draht kurz in eine 3,5 cm große Petrischale, auf deren Boden Silikonelastomer geschichtet ist.</li>
	<li>Positionieren Sie die Larve unter einem Präpariermikroskop mit der Bauchseite nach oben und lokalisieren Sie das Gehirn. Mache mit einer Präparierschere einen Schnitt etwa ein Drittel des Weges am vorderen Ende der Larve. Mache einen weiteren Schnitt an den Maulhaken. Schonen Sie das Gehirn, während Sie die Körper- und Mundhaken entfernen (adaptiert von Janelia Flylight Protocol27).</li>
	<li>Identifizieren Sie die Ansammlung von Motoneuronen-haltigen Nerven aus dem Bauchmark. Ziehen Sie das Gehirn mit einer Pinzette vorsichtig vom Rest der sezierten Larve weg. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe aus dem Gehirn ab. HINWEIS: Sanfter Umgang mit übermäßiger Kraft kann zu Gewebeschäden führen, da das Gehirn zerbrechlich ist.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Mikroskop-Deckglas mit dem Gewebekleber für die Kalziumbildgebung vor, wie in den Schritten 3.2 bis 3.3 beschrieben.</li>
	<li>Aspirieren Sie das präparierte Gehirn vorsichtig mit einer P10-Mikropipette mit 5 μl Dissektionslösung aus der Petrischale. Stoße das Gehirn langsam auf den Klebstoff aus. Bevor der Kleber trocknet, richten Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben aus (mit den beiden Hirnlappen nach unten und dem dorsalen Bauchmark nach oben).</li>
	<li>Mit einer P200-Mikropipette 100 μl des Calcium-Imaging-Puffers über das immobilisierte Larvengehirn auf das Deckglas übertragen.</li>
	<li>Platzieren Sie das Deckglas mit dem Gehirn auf dem inversen Mikroskop, das mit einem konfokalen Spinning-Disk-Scannermodul und einer CCD-Kamera für die Kalziumbildgebung verbunden ist (Abbildung 1B). HINWEIS: Achten Sie bei Ex-vivo-Präparaten darauf, das Gehirn richtig auszurichten, während der Kleber noch feucht ist. Für eine optimale Bildqualität positionieren Sie das Gehirn so, dass der ROI dem Mikroskopobjektiv am nächsten ist, und vermeiden Sie es, überschüssigen Klebstoff in der Nähe des ROI aufzutragen.</li>
</ol>
5. Bildgebungsprotokoll
<ol>
	<li>Öffnen Sie die Software für die Kalziumbildgebung mit dem konfokalen Mikroskop. Aufnahme von Bildern mit einem 10x/1,4 NA-Objektiv mit Filterumschaltung zwischen GFP-Laser (Anregung 488 nm, Intensität 70 %, Emission 525 nm/50 m, OD8) und RFP-Laser (Anregung 561 nm, Intensität 50 %, Emission 610 nm/75 m, OD8). Stellen Sie die Belichtung zwischen 100 ms und 1.000 ms ein, die Verstärkung auf 50 % des entsprechenden Belichtungswerts und einen Binning-Faktor von 2 während der Bildaufnahme.</li>
	<li>Stellen Sie das Mikroskop auf 10-fache Vergrößerung ein und positionieren Sie das Gehirn unter Hellfeldbeleuchtung.</li>
	<li>Identifizieren Sie das interessierende Neuron, indem Sie mit dem RFP-Laser (Anregung auf 561 nm eingestellt) nach dem tdTomato-Signal suchen. HINWEIS: Wählen Sie Sättigung und Gamma reduzieren, um den richtigen Belichtungswert einzustellen.</li>
	<li>Sobald die Region of Interest (ROI) identifiziert ist, wechseln Sie zum GFP-Laser (Anregung auf 488 nm), um GCaMP6f-Signale zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass sowohl tdTomato- als auch GCaMP-Signale kolokalisiert sind, bevor Sie Stack-Images beider Kanäle aufnehmen. HINWEIS: Passen Sie die Bildeinstellungen für tdTomato- und GCaMP6f-Stack-Aufnahmen an, um die Fluoreszenz zu maximieren.</li>
	<li>Erfassen Sie zwei separate Zeitreihenaufzeichnungen von tdTomato- und GCaMP6f-Signalen gleichzeitig mit einer Rate von 0,5 Bildern/s (für insgesamt 2 Minuten). HINWEIS: Das präparierte Larvengehirn bleibt unter diesen Pufferbedingungen etwa 10 Minuten lang lebensfähig; Nach dieser Zeit verschlechtern sich die Signale.</li>
	<li>Sobald die Probe für die Abbildung bereit ist, nehmen Sie zwei separate Zeitreihenaufnahmen von tdTomato- und GCaMP6f-Signalen gleichzeitig mit einer Rate von 0,5 Bildern/s (für insgesamt 2 Minuten) auf. HINWEIS: Das präparierte Larvengehirn bleibt unter diesen Pufferbedingungen etwa 10 Minuten lang lebensfähig; Nach dieser Zeit verschlechtern sich die Signale. HINWEIS: Bei der Durchführung quantitativer Analysen empfehlen wir, die Laserleistung zu erhöhen und die Belichtungsverstärkung des Detektors nach Bedarf anzupassen, während die lineare Intensitätsskalierung beibehalten wird.</li>
</ol>
6. Datenverarbeitung und -analyse
<ol>
	<li>Öffnen und importieren Sie die Signalstacks tdTomato und GCaMP6f in ImageJ (NIH)28.</li>
	<li>Um den korrekten Region of Interest (ROI) zu identifizieren, führen Sie die Signale tdTomato und GCaMP6f zusammen, um die Kolokalisierung zu bestätigen. Teilen Sie nach der Überprüfung die Kanäle tdTomato und GCaMP6f auf.</li>
	<li>Wählen Sie im oberen Menü Plugins | Neu, und klicken Sie auf Makros , um ein neues Makro zu starten. Importieren Sie als Nächstes die benutzerdefinierten ROI-basierten Makros in ImageJ. Wählen Sie den GCaMP6f-Stack aus und klicken Sie auf Ausführen für die Kalziumanalyse.</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Fluoreszenzsignale mit einem benutzerdefinierten ImageJ-Makro (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). Das Makro generiert zunächst Projektionen mit maximaler Intensität, führt eine Bewegungskorrektur mit dem StackReg-Plug-in (Rigid-Registrierungsmodus )29 durch und wendet die Bleichkorrektur an.</li>
	<li>Es erscheint ein Pop-up-Fenster mit der Aufforderung, den ROI manuell auszuwählen, sodass Benutzer manuell einen umfassenden ROI erstellen können. Klicken Sie auf OK , um die Analyse fortzusetzen. Um eine Bewegungskorrektur durchzuführen, stellen Sie sicher, dass das rechteckige Feld den gesamten ROI in allen Frames abdeckt, um eine genaue Bewegungskorrektur zu gewährleisten, während die lokale räumliche und ROI-Form über Frames hinweg beibehalten wird. HINWEIS: Die Aufzeichnungen wurden in ImageJ mit StackReg registriert. Wenn die Bewegung in der Ebene groß war (kumulative XY-Verschiebung &gt; 1 μM) oder die axiale Z-Drift zu einem Fokusverlust führte, wurde die Registrierung unzuverlässig oder die Probe ging vollständig aus dem Bildgebungsfenster verloren. So wurden Proben, die extreme Drift oder abnehmende Kalziumsignale (&gt;30%) aufwiesen, automatisch markiert und von der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen, um genaue Messungen der neuronalen Aktivität zu gewährleisten. Diese Schwellenwerte stimmen mit den allgemein angewandten Qualitätskontrollpraktiken in Calcium-Bildgebungsstudien überein 30,31,32,33. Der Ausschluss stellte auch sicher, dass nur stabile Aufzeichnungen mit zuverlässigen stimulusgebundenen Kalziumtransienten für die Analysen verwendet wurden.</li>
	<li>Extrahieren Sie für die Analyse Fluoreszenzspuren aus manuell definierten zirkulären ROIs, die durch Pixel-Autokorrelation geleitet werden. Diese ROIs werden das gesamte Schlüsselneuronenfeld umfassen.<ol>
		<li>Extrahieren Sie die rohen Fluoreszenzintensitätsdaten für zwei Fluorophore: GCaMP6f/GFP und tdTomato/RFP, mit benutzerdefinierten Makros in ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Wenden Sie ein Schiebefenster mit einem ROI von 20 x 20 Pixeln und einer Schrittweite von 10 Pixeln über das gesamte Sichtfeld an. Für jeden ROI berechnet das Makro: (1) die Intensität über alle Frames, (2) die Baseline-Fluktuationsdifferenz (d. h. die Differenz zwischen den maximalen und minimalen Intensitätswerten während der ersten 10 Frames) und (3) die maximale Intensitätsänderung von Frame zu Frame (ΔF). ROIs, die Intensitätsschwankungen von weniger als 10 Einheiten aufweisen, werden eliminiert, und nur die schärfsten ΔF-Werte werden für die weitere Analyse ausgewählt.</li>
		<li>Normalisieren Sie die Fluoreszenzspuren mit den folgenden Methoden:<ol>
			<li>Fmax- und Fmin-Normalisierung: Berechnen Sie das normalisierte Δ mit der Formel: 
			<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq1.jpg" style="margin: auto;"> Dabei ist F die Rohfluoreszenz zu jedem Zeitpunkt, Fmin die minimale Fluoreszenz (Basislinie) und Fmax die maximale Fluoreszenz während der Aufnahme.</li>
			<li>ΔF/F 0-Normalisierung: Führen Sie zusätzlich eine ΔF/Fo-Normalisierung durch, wobei Fo (Grundlinie) durch die ersten 10 Bilder jeder Aufnahme bestimmt wird, indem Sie die Formel verwenden: 
			<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq2.jpg" style="margin: auto;"> Dabei ist Ft die Fluoreszenz zum Zeitpunkt t und F0 der Ausgangswert, der aus den ersten 10 Bildern berechnet wird.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nachdem Sie GCaMP6f-Signale extrahiert haben, klicken Sie mit der linken Maustaste und wählen Sie Alle, Ausschneiden und Einfügen , um alle Werte in eine neue Excel-Tabelle zu übertragen. Wählen Sie in der oberen Menüleiste Daten | Text in Spalten. Ein Popup-Fenster des Assistenten "Text-to-Column" wird angezeigt. Wählen Sie in Schritt 1 Trennzeichen aus, und klicken Sie dann auf Weiter. Wählen Sie in Schritt 2 unter Trennzeichen die Option Tabulator und Komma aus, und klicken Sie dann auf Weiter. Wählen Sie in Schritt 3 Fertig stellen aus. OPTIONAL: Um die normalisierten Kalziumsignale darzustellen, markieren Sie Fnorm_FminFmax und wählen Sie Streudiagramm aus.</li>
	<li>Suchen Sie nach einer generierten .csv Datei, die Folgendes enthält: (1) die Rohfluoreszenzwerte F, (2) ΔF/Fo und (3) Fnorm (normalisierte Fluoreszenzintensität). Organisieren Sie den endgültigen Datensatz in vier Spalten: (1) Zeit (Frames), (2) Stichprobenbedingung (ausgehungert oder gefüttert), (3) Replikat-ID (einzelne Stichprobe) und (4) normalisierte Intensität (Fnorm-Werte skaliert von 0 bis 1).</li>
	<li>Führen Sie abschließend eine Datenanalyse und -visualisierung in R mit benutzerdefinierten R-Skripts durch (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. siehe Materialtabelle).<ol>
		<li>Importieren Sie das benutzerdefinierte R-Skript in ein neues R-Projekt. Stellen Sie sicher, dass die erforderlichen R-Pakete, einschließlich ggplot2, dplyr und readr, installiert und aktualisiert werden, bevor Sie die Analyse ausführen.</li>
		<li>Beginnend mit Zeile 1 des benutzerdefinierten R-Skripts klicken Sie auf Kontinuierlich ausführen , um die Kalziumanalyse durchzuführen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Ausgabe Heatmaps enthält, die die normalisierte Kalziumintensität für die ersten 30 Frames, 60 Frames und alle Frames der Zeitreihenaufzeichnung veranschaulichen, sowie Boxplots, um den Median der normalisierten Intensitäten anzuzeigen.</li>
		<li>Beurteilen Sie die Signifikanz der normalisierten Kalziumintensität mit dem Mann-Whitney U-Test .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Abfallentsorgung und Dekontamination
<ol>
	<li>Entfernen Sie nach den Experimenten grobe Ablagerungen von Werkzeugen und Oberflächen unter fließendem Wasser und desinfizieren Sie sie dann mit 70 % Ethanol oder 10 % Bleichmittel, gefolgt von sterilem Wasser. Arbeiten Sie auf einer desinfizierten Oberfläche und waschen Sie sich die Hände, nachdem Sie die Handschuhe ausgezogen haben. Essen und trinken Sie nicht im Labor.</li>
	<li>Legen Sie Larvengewebe und kontaminierte Einwegartikel vor der Entsorgung in Biohazard-Beutel und autoklavieren Sie sie.</li>
	<li>Entsorgen Sie vollständig ausgehärtete Klebstoffabfälle im allgemeinen Müll; Nicht ausgehärteter Klebstoff und kontaminierte Einwegartikel müssen in einem verschlossenen, gekennzeichneten Behälter für gefährliche chemische Abfälle gesammelt werden.</li>
	<li>Legen Sie alle scharfen Gegenstände (Klingen, Nadeln, Glasscherben) in einen durchstichsicheren Behälter für scharfe Gegenstände.</li>
	<li>Sammeln Sie brennbare Lösungsmittel (Ethanol, Aceton) in gekennzeichneten, brennbaren Abfallbehältern.</li>
</ol>

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<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).</li>
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<li>Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+facilitation+by+neuropeptide+signaling+mediates+odor-driven+food+search%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search.</a> Cell. 145 (1), 133-144 (2011).</li>
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<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn%3A+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Fliegenbestände & Instandhaltung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutrifly-Fliegenfutter</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-112</td><td></td></tr><tr><td>UAS-GCaMP6f, tdTomato</td><td>Geschenk von Dr. JH Kim&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)</td><td>BDSC</td><td>49232</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien für Hunger-Protokoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 cm Petrischale</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien für Bildgebungs- und Dissektionspuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>J.T. Baker, Avantor Sciences</td><td>JT1311-1</td><td>CAS: 1311-01, 500g</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16828.36</td><td>CAS: 50-99-7, 500g</td></tr><tr><td>HEPES-2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-Ethanesulfonsäure</td><td>J.T. Baker, Avantor Sciences</td><td>JT4018-1</td><td>CAS: 4018-01, 100g</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>VWR</td><td>97064-150</td><td>CAS: 7786-30-3, 100g</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J64189.36</td><td>CAS: 7447-40-7, 500g</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>EMD Milipore Sigma</td><td>EMD-SX0420-1</td><td>CAS: 7647-14-5, 500g</td></tr><tr><td>Werkzeuge und Reagenzien für die Sektion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissektionspuffer</td><td></td><td></td><td>Im Text bereitgestellte Komposition</td></tr><tr><td>Olympus Petrischalen, 60 x 15 mm belüftet</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomerbasis</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>24236-10A</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer-Basenhärtemittel</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>24236-10B</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Stil 5, EMS</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>78320-5</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors – 3mm Schneidkante</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebende und Montagegeräte/Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal-Scanner-Modul</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-W1</td><td>Verbindung zum Mikroskop</td></tr><tr><td>Bildgebungspuffer</td><td></td><td></td><td>Im Text bereitgestellte Komposition</td></tr><tr><td>Invertiertes Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8&nbsp;</td><td>Angeschlossen an ein rotierendes Scheiben-Konfokalscanner-Modul und eine CCD-Kamera</td></tr><tr><td>Mikroskopabdeckungsglas, 24 mm x 50 mm, # 1,5 Dicke</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>MWI Veterinär-GLUTURE-Topischer Klebstoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0632797</td><td></td></tr><tr><td>Reine Vaseline</td><td>Walgreens</td><td>912556</td><td></td></tr><tr><td>Links zu öffentlich zugänglichen Ressourcen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td></td><td></td><td>https://www.biorender.com/</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>912556</td><td>https://imagej.net/ij/</td></tr><tr><td>Janelia Flylight Protokoll-Video</td><td>https://www.janelia.org/</td><td></td><td>https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o</td></tr><tr><td>Mathew Lab Github</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging</td></tr></tbody></table>

in-vivo- und ex-vivo-calcium-bildgebung eines neurons des olfaktorischen schaltkreises in der dritten larve von drosophila melanogaster im dritten stadium

In-vivo and Ex-vivo Calcium Imaging of an Olfactory Circuit Neuron in the Third-Instar Drosophila melanogaster Larva

Um unseren Ansatz zur Bildgebung von Larvenkalzium zu demonstrieren, haben wir ihn erfolgreich sowohl auf in-vivo- als auch auf ex-vivo-Präparate der Drosophila-Larven angewendet (Abbildung 2 und Abbildung 3, Video 1, Video 2, Video 3 und Video 4). Wir haben die Calciumdynamik in Drosophila-Larven im dritten Stadium gemessen, die GCaMP6f und Td-Tomate exprimieren, in einem ein...

In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

Calcium imaging is crucial for studying neural dynamics and brain function. However, current methods for imaging calcium in Drosophila larvae are ...

in-vivo-ex-vivo-calcium-imaging-an-olfactory-circuit-neuron-third

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Betäubung und Bildgebung von...

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Wir beschreiben eine etablierte Technik zur Messung und Analyse Gerüche hervorgerufene Kalzium-Reaktionen im Antennallobus...

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Dieses Video beschreibt die In-vivo-Calcium-Bildgebung in Drosophila-Neuronen mit GCaMP. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz von Pilzkörperneuronen während eines olfaktorischen Konditionierungsexperiments aufgezeichnet werden können.

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung neuronaler Aktivität

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vivo Kalziumbildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren in Fliegen. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Fliegen für die Mikroskopie, zur Durchführung der olfaktorischen Konditionierung und zur Visualisierung des geruchsinduzierten Kalziumeinstroms.

im lebenden Organismus Calcium-Imaging mit synaptisch lokalisierten Calciumsensoren in Drosophila melanogaster

Quelle: Ishimoto, H. et. al., Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Visualisierung der Gehirnreaktionen auf endokrine Signalwege bei Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Kalziumbildgebung zur UntersuchungDrosophila Gehirnreaktionen auf Neuropeptide. Neuronen, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator exprimieren, zeigen die intrazelluläre Kalziumdynamik und funktionelle Reaktionen auf Signalmoleküle.

Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Untersuchung der Reaktionen des Drosophila-Gehirns auf Neuropeptide

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die ex-Vivo Calcium Bildgebung des Gehirns Drosophila . Bei dieser Methode können der Puffer, testen Sie ihre Fähigkeit, bestimmte Nervenzellen im Gehirn zu aktivieren natürliche oder synthetische Verbindungen zugewiesen werden.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die ex vivo Kalziumbildgebung in GCaMP6-exprimierenden adulten Drosophila vor, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. Das Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von iktalen Ereignissen in adulten Drosophila durch ex vivo Kalzium-Bildgebung und ermöglicht die Erforschung der potenziellen Mechanismen der Epilepsie auf zellulärer Ebene.

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Ein Calcium-Imaging-Ansatz ermöglicht die Aufzeichnung von geschmacksinduzierten Reaktionen im Gehirn wacher Fliegen, während eine Lösung auf das Labellum aufgetragen wird. Primäre gustatorische Reaktionen in Drosophila melanogaster werden als Beispiel verwendet, aber dieses Protokoll kann angepasst werden, um nachgeschaltete Neuronen oder andere Spezies zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Kalzium-Bildgebung von geschmacksinduzierten neuronalen Reaktionen bei adulten Drosophila

Lernen Sie Calcium-Bildgebung in olfaktorischen Neuronen von Drosophila melanogaster-Larven mit GLUture-Klebstoff. Diese kostengünstige Methode ermöglicht stabile in-vivo- und ex-vivo-Aufnahmen für neurophysiologische Studien.

In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium (Video) | JoVE Journal

In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

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