In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

Dieses Protokoll verwendet GLUture Gewebekleber, um die Fähigkeit in der In-vivo- und Ex-vivo-Kalziumbildgebung zu verbessern. Dies ermöglicht es den Forschern, die Kalziumdynamik in einem olfaktorischen Schaltkreisneuron in Drosophila-Larven des dritten Instars zu verstehen. Einfachheit und Kosteneffizienz sind die beiden Hauptvorteile dieser Technik, die Experimente in der neurophysiologischen Forschung zuverlässiger und zugänglicher machen.

Bereiten Sie zwei Fütterungskammern vor, indem Sie ein kleines Quadrat Chem-Tuch in sechs Zentimeter große Petrischalen geben. Bei Hunger 350 Mikroliter destilliertes Wasser hinzufügen. Bei nicht verhungerten Zuständen fügen Sie 350 Mikroliter 0,2 molare Saccharoselösung hinzu.

Setzen Sie eine gleiche Anzahl gewaschener Larven in jede Futterkammer um. Lassen Sie die Larven zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit Saccharose, nicht verhungertem oder destilliertem Wasser fressen. Auf einem 24 mal 50 Millimeter großen, 1,5 Millimeter dicken Mikroskop-Deckglas legen Sie eine Vertiefung aus Vaseline, die aus einer Spritze abgegeben wird. Geben Sie einen kleinen Tropfen GLUture topischen Gewebekleber in die Mitte des Deckglases.

Verteilen Sie die GLUture mit einem Glasstab gleichmäßig in einer dünnen, gleichmäßigen Schicht. Übertragen Sie vorsichtig eine einzelne Larve mit einer Bürste oder einem dünnen Draht auf die GLUture. Drücken Sie die ventrale Seite der Larven vorsichtig auf den Kleber.

Lassen Sie die GLUture trocknen und stellen Sie sicher, dass die Larven vollständig immobilisiert sind. Sobald die Larve immobilisiert ist, tauchen Sie die Larve in 100 Mikroliter Imaging-Puffer. Platzieren Sie das Deckglas auf einem inversen Mikroskop Leica DMi8, das mit einem konfokalen Scannermodul CSU-W1 von Yokogawa und einer CCD-Kamera für die Kalziumbildgebung verbunden ist.

Bereiten Sie ein Mikroskop-Deckglas mit GLUture für die Calcium-Bildgebung vor, wie in den Schritten 3.2 bis 3.3 beschrieben. Schließen Sie die Sektion ab, wie von Ishimoto und Sano, 2018 beschrieben. Aspirieren Sie das präparierte Gehirn vorsichtig mit einer P-10-Mikropipette mit fünf Mikrolitern Sezierlösung aus der Petrischale.

Stoße das Gehirn langsam auf die GLUture aus. Bevor die GLUture trocknet, richten Sie das Gehirn mit der Rückenseite nach oben aus, wobei die beiden Hirnlappen nach unten und der dorsale Bauchmark nach oben zeigen. Übertragen Sie mit einer P-200-Mikropipette 100 Mikroliter Calcium-Imaging-Puffer über das immobilisierte Larvengehirn auf das Deckglas.

Öffnen Sie VisiView für die Bildgebung von Kalzium mit dem inversen Rotationsmikroskop Leica DMi8. Nehmen Sie Bilder mit einem beliebigen 10X/1,4-Objektiv mit Filtern auf und wechseln Sie zwischen dem GFP-Laser und dem RFP-Laser. Die Belichtungswerte reichen von 100 bis 1000 Millisekunden und die Verstärkung ist auf 50 % des entsprechenden Belichtungswerts eingestellt.

Bei der Bilderfassung wird ein Gebotsfaktor von zwei angewendet. Identifizieren Sie das Neuron von Interesse, indem Sie mit dem RFP-Laser nach dem tdTomato-Signal suchen. Sobald die Region of Interest identifiziert ist, wechseln Sie zum GFP-Laser, um GCaMP6f-Signale zu erfassen.

Stellen Sie sicher, dass sowohl tdTomato- als auch GCaMP-Signale umgangssprachlich sind, bevor Sie Stack-Images beider Kanäle aufnehmen. Erfassen Sie zwei separate Zeitreihenaufzeichnungen von tdTomato- und GCaMP6f-Erfolgssignalen gleichzeitig mit einer Rate von 0,5 Bildern pro Sekunde für insgesamt zwei Minuten. Importieren Sie die Signalstacks tdTomato und GCaMP6f in ImageJ.

Um die richtige Region of Interest zu identifizieren, führen Sie die Signale tdTomato und GCaMP6f zusammen, um die Kolokalisierung zu bestätigen. Teilen Sie nach der Überprüfung die Kanäle tdTomato und GCaMP6f auf. Importieren Sie die benutzerdefinierten ROI-basierten Makros in ImageJ.

Wählen Sie den GCaMP6f-Stack aus und klicken Sie auf Run für die Calciumanalyse. Das Makro generiert zunächst Projektionen mit maximaler Intensität, führt eine Bewegungskorrektur mit dem Stack Reg-Plugin durch und wendet die Bleichkorrektur an. Die Bewegungskorrektur wurde durchgeführt, indem ein breiter rechteckiger Bereich von Interesse, wie z. B. der Hirnlappen, auf jedem Bild definiert wurde.

Der rechteckige Quader muss den gesamten ROI in allen Frames abdecken, um eine genaue Bewegungskorrektur zu gewährleisten und gleichzeitig die lokale, räumliche und ROI-Form in allen Frames beizubehalten. Für jeden ROI berechneten die Makros eins die Intensität über alle Frames, zwei die Baseline-Schwankungsdifferenz, z. B. die Differenz zwischen den maximalen und minimalen Intensitätswerten während der ersten 10 Frames, und drittens die maximale Intensitätsänderung von Frame zu Frame, Delta F.ROIs, die Intensitätsschwankungen von weniger als 10 Einheiten zeigten, wurden eliminiert. Der endgültige Datensatz wurde in vier Spalten organisiert: eins, Zeit und Frames, zwei, Stichprobenbedingungen, die ausgehungert oder gefüttert wurden, drei Replikat-IDs, einzelne Stichproben und vier, normalisierte Intensität.

F-Normwert skaliert von null bis eins. Schließlich wurden die Datenanalyse und -visualisierung in R unter Verwendung benutzerdefinierter R-Skripte durchgeführt. Die erforderlichen Pakete, einschließlich ggplot2, dplyr und readr, wurden vor dem Ausführen der Analyse installiert und aktualisiert.

Die Ausgabe enthielt Heatmaps, die die normalisierte Kalziumintensität für die ersten 30 Frames, 60 Frames und alle Frames bei der Zeitreihenaufzeichnung veranschaulichen, sowie Boxplots, um den Median der normalisierten Intensitäten zu zeigen. Die Signifikanz der normalisierten Calciumintensität wurde mit dem Mann-Whitney U-Test bewertet. Abbildung eins ist ein Schema für in-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebungsaufbauten.

Die ganze Larvenprobe A oder Larvenhirnprobe B wurde auf einer dünnen Schicht GLUture in festem Blau fixiert, in einer Vertiefung aus Vaseline verteilt und rund auf einem Mikroskop-Deckglas aufgebahrt. Die Proben wurden in hellblauen Kalziumpuffer getaucht und zur Bildgebung auf ein konfokales Mikroskop mit invertierter Spinning-Disc gelegt. Zeitreihen von Kalziumfluoreszenzbildern der Proben wurden aufgenommen.

Der Schaltplan wurde mit BioRender erstellt. Abbildung zwei zeigt die GCaMP6f-Fluoreszenzbildgebung. A, geteilte Bilder, die Fluoreszenz im 488-Nanometer-Kanal, GCaMP6f und grün, und den 525-Nanometer-Kanal, tdTomato in rot, zeigen.

Das zusammengeführte Bild wird im rechten Bereich angezeigt. B, Beispiel für rohe Fluoreszenzspuren im Laufe der Zeit für GCaMP6f in Grün und tdTomato in Rot in Keystone-LNs. Die Fluktuation der GCaMP6f-Fluoreszenz deutet auf eine Kalziumaktivität hin, während das stabile tdTomato-Signal als Kontrolle zur Identifizierung von Keystone-LNs verwendet wird.

C, repräsentative GCaMP6f-Signalbilder für In-vivo-Oberteile und Ex-vivo-Unterplattenpräparationen. Nicht verhungerte Proben sind auf der linken Seite und ausgehungerte Proben auf der rechten Seite dargestellt. Abbildung drei zeigt GCaMP6f-Fluoreszenzmessungen.

A, das obere linke Feld zeigt eine Heatmap, die die durchschnittliche zeitliche Dynamik der Kalziumsignale von Schlüsselelementen von nicht verhungerten Larven (N=5) und verhungerten Larven (N=5) in der In-vivo-Präparation ganzer Larven zeigt. Das Boxdiagramm oben rechts vergleicht die normalisierte Kalziumsignalintensität zwischen nicht verhungerten Proben in grauen und verhungerten in weißen Proben in der In-vivo-Präparation. Mann-Whitney U-Test ist P kleiner als 0,001.

B, das untere linke Feld zeigt eine Heatmap, die die durchschnittliche bis portale Dynamik von Calciumsignalen von Keystone LN von nicht verhungertem, N=5 und verhungertem N=5 im ex-vivo präparierten Gehirn zeigt. Das Boxplot im unteren rechten Feld vergleicht die normalisierte Kalziumsignalintensität zwischen nicht verhungerten, grauen und ausgehungerten, weißen Proben in der Ex-vivo-Präparation. Der Mann-Whitney-U-Test B beträgt weniger als 0,001.

Um unseren Ansatz zur Bildgebung von Larvenkalzium zu demonstrieren, haben wir ihn erfolgreich sowohl auf in-vivo- als auch auf ex-vivo-Präparate der Drosophila-Larven angewendet. In beiden Präparaten beobachteten wir eine höhere Keystone-LN-Aktivität und ausgehungerte Proben im Vergleich zu nicht verhungerten Proben. Diese höhere Keystone-Aktivität wurde deutlich in Heatmaps beobachtet, die zeitliche Darstellungen der Antworten über 60 Sekunden zeigten, und in Boxplots, die durchschnittliche Signalintensitätswerte darstellten.

Diese Ergebnisse stimmen mit den jüngsten Studien überein, die eine höhere olfaktorische Neuronenaktivität bei hungernden Tieren zeigen. Wie in diesem Video gezeigt, reduziert der GLUture Gewebeklebstoff Bewegungsartefakte sowohl in in-vivo- als auch in ex-vivo-Setups erheblich. Diese Methode könnte auch angewendet werden, um verschiedene Arten von Reizen zu untersuchen, zum Beispiel die äußere Anwendung von Gerüchen und die interne Überfusion von Neuromodulatoren.