Probenvorbereitung für Einzelzell-Massenspektrometrie-Metabolomik-Studien: Kombiniertes Waschen, Abschrecken, Trocknen und Lagern von Zellen

Wir haben Protokolle entwickelt, um die Integrität zellulärer Metaboliten für Einzelzell-Massenspektrometrie-Studien zu erhalten. Wir untersuchten, wie sich Wasch-, Abschreck- und Lagerbedingungen auf Zellmetaboliten auswirken. In jüngster Zeit wurden neue Methoden zur Probenvorbereitung und Massenspektrometrie entwickelt, um Einzelzell-Metabolomik-Studien voranzutreiben und die zelluläre Heterogenität und Krankheitsmechanismen besser zu verstehen.

Forscher müssen mehrere wichtige Herausforderungen meistern, darunter eine begrenzte Probenmenge, eine verringerte Nachweisempfindlichkeit aufgrund der Probenkomplexität und veränderte Metaboliten aufgrund der Probenvorbereitung und -analyse. Wir demonstrieren umfassende Probenvorbereitungstechniken, die zelluläre Metaboliten und die Zellintegrität für metabolomische Einzelzell-Massenspektrometrie-Studien erhalten können. Unsere Protokolle könnten eine einfache und effektive Möglichkeit für die Vorbereitung, Lagerung und den Transport von Proben für metabolomische Einzelzellstudien unter Verwendung verschiedener massenspektrometrischer Techniken bieten.

Zu Beginn inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Überwachen Sie die Konfluenz der Zellen täglich und passieren Sie sie, wenn die Kulturen eine Konfluenz von 80 % erreichen. Zum Passagieren das Medium aus der Schale ansaugen und einmal mit fünf Millilitern PBS spülen.

Inkubieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern 0,25%Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten, um die Zellablösung zu erleichtern. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie acht Milliliter vorgewärmtes vollständiges Medium hinzufügen und vorsichtig pipettieren, um die Zellen zu dispergieren. Übertragen Sie einen Milliliter der Suspension in neun Milliliter frisches, vollständiges Medium für die Zählung der Zellen.

Um die Zellen zu säen, verdünnen Sie sie auf eine Endkonzentration von eins mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter. Platzieren Sie einzelne 18-Millimeter-Glasabdeckungsschlüpfe in den Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Geben Sie zwei Milliliter des vollständigen Mediums und 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung, um zweimal 10 hoch der Leistung von fünf Zellen pro Vertiefung zu erreichen.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht, um eine Anheftung zu ermöglichen. Zum Waschen der Zellen geben Sie zwei Milliliter kalte Ammoniumformiatlösung in jede Vertiefung der 12-Well-Platte. Heben Sie dann mit einer sterilen Pinzette vorsichtig jedes Deckglas mit Adhärenzzellen aus seiner Vertiefung und legen Sie es für zwei bis drei Sekunden kurz in eine separate Vertiefung, die mit zwei Millilitern kalter 0,9%iger Ammoniumformiatlösung vorgefüllt ist.

Legen Sie jeden mit Ammoniumformiat gespülten Deckglas mit den Zellen nach oben in eine Petrischale in einem Aluminiumfolienbehälter. Gießen Sie langsam 10 bis 20 Milliliter flüssigen Stickstoff über die Deckgläser, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. Kippen Sie die Petrischale sofort mit einer Pinzette, um den restlichen flüssigen Stickstoff zu dekantieren.

Setzen Sie die Petrischale mit den Flüssigstickstoff-Kühlabdeckungen mit Kryohandschuhen und einer isolierten Pinzette in die Vakuumkonzentratorkammer ein. Verarbeiten Sie die Proben fünf bis sieben Minuten lang mit den Standard-Vakuumeinstellungen, bis der sichtbare flüssige Stickstoff verdampft ist und die Deckgläser trocken erscheinen. Achten Sie darauf, dass die getrockneten Deckgläser keine Reste von flüssigem Stickstoff oder Eiskristallen enthalten.

Wickeln Sie den Behälter anschließend mit einem Papiertuch ein und stellen Sie ihn für 48 Stunden in einen 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank. Nach der Lagerung die Deckgläser mit der Petrischale 10 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen. Stellen Sie sicher, dass kondensierter Frost oder Wasser auf den Deckgläsern vollständig verschwindet, bevor Sie sie aus dem Exsikkator nehmen.

Teilen Sie die Proben in zwei Gruppen ein und behandeln Sie sie entsprechend. Montieren Sie nun die einzelne Sonde auf dem XYZ-Tisch und befestigen Sie sie an einem motorisierten XYZ-Manipulator, der unter einem Digitalmikroskop positioniert ist. Koppeln Sie den Einzelsondenaufbau mit einem Massenspektrometer für die SCMS-Analyse.

Als Extraktionslösungsmittel wird Acetonnitril mit einem Gehalt von 0,1 % Ameisensäure mit einer Reinheit von mindestens 99,9 % verwendet und mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 150 Nanolitern pro Minute gefördert. Stellen Sie die Massenspektrometrie-Parameter für positive und negative Ionenmoden ein. Platzieren Sie nun die beiden Deckgläser der Gruppe eins und der zweiten Gruppe zusammen auf dem motorisierten XYZ-Tisch des SCMS-Setups mit einer Sonde und wählen Sie mit dem Mikroskop nach dem Zufallsprinzip Zellen für die Analyse aus.

Nach der Erfassung von Massenspektren analysieren Sie etwa 30 Zellen pro Gruppe mit derselben einzigen Sonde, derselben Lösungsmittelflussrate und derselben Ionisationsspannung. Verarbeiten Sie die SCMS-Rohdaten mit einem benutzerdefinierten R-Skript vor und wenden Sie die Hintergrund- und Rauschentfernung an, gefolgt von einer Normalisierung der Ionenintensität auf den Gesamtionenstrom. De-isotope der SCMS-Daten mit dem Python-Paket MSD isotope.

Führen Sie die Peak-Ausrichtung mit einem internen Python-Skript durch. Wenden Sie eine Abschnittsbreite von 0,01 Master-Charge-Verhältnis für das Binning und eine Massentoleranz von 0,01 Master-Charge-Verhältnis oder fünf Teile pro Million für die Peak-Ausrichtung an. Führen Sie statistische Datenanalysen mit Metabo Analyst 6.0 durch.

Führen Sie einen T-Test durch und erstellen Sie eine Heatmap, die die relativen Metabolitenwerte zeigt. Wählen Sie die Option Top 100 und T-Test oder Inova verwendet, um die Top 100 Metaboliten nach Signifikanz geordnet zu generieren und eine Heatmap mit diesen Top 100 Metaboliten mit signifikanten Unterschieden zu erstellen. Durchsuchen Sie schließlich die genauen Master-Charge-Werte mit der menschlichen Metabolom-Datenbank mit einer Massentoleranz von 10 Teilen pro Million für die Datenbanksuche.

Die Analyse der Hauptkomponenten im positiven Ionenmodus zeigte, dass sich Gruppe eins und Gruppe zwei eng überlappen, was auf sehr ähnliche Metabolitenprofile hinweist. Im Negativ-Ionen-Modus wurde ein vergleichbares Muster beobachtet, obwohl Gruppe zwei etwas deutlicher zu sein schien. Die Heatmap-Analyse der 100 wichtigsten Metaboliten zeigte in beiden Ionenmodi sehr konsistente Abundanzmuster zwischen Gruppe eins und Gruppe zwei.

Es werden keine größeren Verschiebungen oder gruppenspezifische Clusterbildung beobachtet. Geringfügige Variationen in einigen Metabolitenclustern können jedoch Unterschiede in der Ionisationseffizienz oder der Metabolitenstabilität widerspiegeln.