Name: Probenvorbereitung für Einzelzell-Massenspektrometrie-Metabolomik-Studien: Kombiniertes Waschen, Abschrecken, Trocknen und Lagern von Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Lernen Sie optimierte Protokolle zur Probenvorbereitung für Einzelzell-Massenspektrometrie-Metabolomik. Diese Methode mit Flüssigstickstoff-Abschrecken bewahrt Metabolitenintegrität und ermöglicht zuverlässige metabolomische Analysen.

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<table><tbody><tr><td>-80 Grad C Gefrierschrank</td><td>Eppendorf, New Brunswick</td><td>U700</td><td>Probenvorbereitung </td></tr><tr><td>Acetontril</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>240744</td><td>Aufbau des SCMS-Experiments</td></tr><tr><td>Ammoniumformiat </td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>401152500</td><td>Probenvorbereitung </td></tr><tr><td>Deckglas 18 mm</td><td>VMR Mikro-Deckglas</td><td>48380046</td><td>Zellkultur </td></tr><tr><td>Digitales Stereomikroskop</td><td>Shenzhen D& F Co.</td><td>Superaugen T004</td><td>Analyse</td></tr><tr><td>Quarzrohr mit doppelter Bohrung, 1.120"x0.005"x12"</td><td>Friedrich & Dimmock, Inc.</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td>Herstellung mit einer Sonde</td></tr><tr><td>Epoxydharz</td><td>Devcon (Englisch)</td><td>Art.-Nr. 20945</td><td>Herstellung mit einer Sonde</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Wards Wissenschaft </td><td>470301-120 500 ml</td><td>Aufbau des SCMS-Experiments</td></tr><tr><td>Quarzglas-Kapillare, ID: 40 &micro; m, AD: 100 &micro; m</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP040105</td><td>Herstellung mit einer Sonde</td></tr><tr><td>Quarzglas-Kapillare, ID: 50 &micro; m, OD: 150 &micro; m</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150015</td><td>Aufbau des SCMS-Experiments</td></tr><tr><td>Abdeckgläser aus Glas, 18mm</td><td>VWR </td><td>48380046</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>HyClone Synthetisches Serum (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH3006603</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Brutkasten </td><td>HeraCell (Heraeus)</td><td></td><td>Zellkultur </td></tr><tr><td>Laser-Abzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modell P-2000</td><td>Herstellung mit einer Sonde</td></tr><tr><td>LED-UV-Lampe</td><td>Foshan Liang Ya Dentalgeräte</td><td>LY-C240</td><td>Herstellung mit einer Sonde</td></tr><tr><td>McCoy's 5A </td><td>Gibco </td><td>2537128</td><td>Zellkultur </td></tr><tr><td>Mikrounion</td><td>IDEX Gesundheit & Gesundheit Wissenschaft GmbH</td><td>M-539</td><td>Aufbau des SCMS-Experiments</td></tr><tr><td>Modifizierte FAIMS pro-Schnittstelle </td><td>Thermo Fischer </td><td>98100-20046</td><td>Analyse </td></tr><tr><td>MycoAlert PLUS Mykoplasmen-Nachweiskit</td><td>Lonza</td><td>Nr. LT07-703</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Optische Platine </td><td>Thorlabs Inc., Newton</td><td></td><td>Analyse </td></tr><tr><td>Optima Wasser in LC/MS-Qualität (Fisher Chemical, USA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>W6500</td><td>Probenvorbereitung </td></tr><tr><td>Orbitrap Exploris 240 Massenspektrometer </td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Aufbau des SCMS-Experiments</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>VWR</td><td>0780-50L</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>SpeedVac Konzentrator (Savant)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td> SPD111 V</td><td>Probenvorbereitung </td></tr><tr><td>Spritzenpumpe (SKE10)</td><td>Chemyx Inc.</td><td>80561</td><td>Aufbau des SCMS-Experiments</td></tr><tr><td>Spritze, 250 & Mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>Artikel-Nr.: 1725LTN250UL</td><td>Aufbau des SCMS-Experiments</td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-Rad Laboratorien </td><td>Artikel-Nr.: 1450102EDU</td><td>Zellzahl</td></tr><tr><td>Gewebekulturschale, 100mm</td><td>Fischer wissenschaftlich </td><td>FB012924</td><td>Zellkultur </td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-072</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>USB-Digitalmikroskop ("Scorpio" 500 Zoom)</td><td>Chinavasion, Großhandel Ltd.</td><td></td><td>Analyse </td></tr><tr><td>UV-härtendes Harz</td><td>Prime Dental</td><td>Artikel-Nr. 006.030</td><td>Herstellung mit einer Sonde</td></tr><tr><td>Xcalibur-Software</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYZ-Tisch (CONEX- MFACC)</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td>Analyse </td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung für einzelzell-massenspektrometrie-metabolomik-studien: kombiniertes waschen, abschrecken, trocknen und lagern von zellen

Sample Preparation for Single Cell Mass Spectrometry Metabolomics Studies: Combined Cell Washing, Quenching, Drying, and Storage

Dieser Bericht beschreibt eine Methodik, die Zellwäsche, schnelles Abschrecken der Zellen, Vakuumtrocknung und Lagerung bei -80 °C integriert (Abbildung 1). Konkret ist dieser Ansatz darauf ausgelegt, den metabolomischen Zustand von Zellen vor der SCMS-Analyse zu erhalten. Die Wirksamkeit dieses Protokolls wurde getestet, indem Zellen unter zwei verschiedenen Bedingungen vorbereitet wurden: frisch abgeschreckte und getrocknete Zellen (Gruppe 1, die als Kontrolle diente) und abgeschreckte, getrocknete und bei -80 °C gelagerte Zellen (Gruppe 2). Jede Gruppe wurde mit der Einzelsonden-SCMS-Methode sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus analysiert. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die Visualisierung von Heatmaps wurden verwendet, um die Unterschiede in den metabolomischen Profilen zwischen den Gruppen zu bewerten.
Die PCA-Ergebnisse im positiven Ionenmodus (Abbildung 2A) zeigten, dass die Gruppen 1 und 2 insgesamt ähnliche Metabolitenprofile aufwiesen. Die nahezu identischen Profile von Gruppe 1 und Gruppe 2 zeigen, dass eine Lagerung von -80 °C für 48 h das Metabolom nicht signifikant verändert, wenn die Zellen vor dem Trocknen richtig abgeschreckt werden. Im negativen Ionenmodus (Abbildung 2B) wird ein vergleichbares Muster beobachtet, obwohl Gruppe 2 etwas deutlicher zu sein scheint - möglicherweise aufgrund von Ionisationsunterschieden zwischen bestimmten Metabolitenklassen, z. B. werden Phosphatidylcholine im positiven Modus besser nachgewiesen, während Fettsäuren im negativen Modus effizienter ionisieren60. Trotz dieser Variation stützt die konsistente Clusterbildung zwischen den Gruppen 1 und 2 über beide Modi hinweg die Schlussfolgerung, dass das integrierte Abschreck-Trocknungs-Speicherprotokoll die metabolische Integrität aufrechterhält.
Die Heatmap-Analyse validierte die PCA-Ergebnisse weiter, indem sie die relativen Häufigkeiten der 100 wichtigsten Metaboliten in zwei Gruppen darstellte. Wie in Abbildung 3 gezeigt, weisen die Top-100-Metaboliten in beiden Ionenmodi sehr konsistente Abundanzmuster zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 auf. Es werden keine größeren Verschiebungen oder gruppenspezifische Clusterbildung beobachtet, obwohl geringfügige Variationen in einigen Metabolitenclustern Unterschiede in der Ionisationseffizienz oder Metabolitenstabilität widerspiegeln können. Diese Ergebnisse zeigen zusammengenommen, dass der Workflow des Abschreckens, Trocknens und Lagerns zelluläre metabolomische Profile mit hoher Genauigkeit bewahrt und sich daher gut für SCMS-Anwendungen in der Umgebungsumgebung eignet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68995/68995fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Allgemeiner Arbeitsablauf für die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS)-Analyse, bei der untersucht wird, wie sich LN 2-Quenching und 48-stündige Lagerung bei -80 °C auf die Metabolitenprofile in Einzelzellen auswirken. (A) Die Zellen wurden ausgesät, inkubiert und mit Ammoniumformat-Lösung (AF) gespült. (B) Zwei Zellgruppen wurden vorbereitet - Gruppe 1: Die Zellen wurden gewaschen, abgeschreckt und gefriergetrocknet für sofortige SCMS-Experimente ohne Lagerung; Gruppe 2: Die Zellen wurden gewaschen, abgeschreckt, gefriergetrocknet und bei -80 °C gelagert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68995/68995fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68995/68995fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Hauptkomponentenanalyse (PCA) von SCMS-Daten von HCT-116-Zellen in Versuchsgruppen im (A) positiven Ionenmodus und (B) im negativen Ionenmodus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68995/68995fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68995/68995fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Heatmaps, die die relativen Konzentrationen der 100 wichtigsten Metaboliten zeigen, die in einzelnen HCT-116-Zellen nachgewiesen wurden, die unter verschiedenen Bedingungen hergestellt wurden, dargestellt für (A) den positiven Ionenmodus und (B) den negativen Ionenmodus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68995/68995fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Probenvorbereitung für Einzelzell-Massenspektrometrie-Metabolomik-Studien: Kombiniertes Waschen, Abschrecken, Trocknen und Lagern von Zellen

Single-cell mass spectrometry (SCMS) has become an indispensable tool for studying cellular metabolism. Owing to advancements in modern mass spectrometry ...

sample-preparation-for-single-cell-mass-spectrometry-metabolomics

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Forschung

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Chemie

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