Präzise Induktion und Unterscheidung von Husten- und Niesreflexen bei Mäusen

Dieses Protokoll konzentriert sich auf den Atemreflex bei Mäusen. Wir wollen Luftröhre und Nasenhöhle stimulieren, um Husten und Niesen auszulösen, und unterscheiden diese beiden Arten von Ereignissen anhand der Audiomerkmale. Frühere Studien verwendeten oft vernebltes Capsaicin oder Zitronensäure, um die Atemkontrolle sowie Husten- und Niesverhalten bei Mäusen zu stimulieren.

Es bleibt jedoch unklar, ob die Atemkontrollstimulation durch Verneblung Husten, Niesen oder beides auslöst, da es derzeit keine zuverlässige Methode zur Unterscheidung dieser beiden Reaktionen gibt. Für dieses Projekt entwickelten wir eine Methode, um Husten und Niesen durch gezielte Stimulation der Luftröhre oder Nasenhöhle zu induzieren. Wir nutzten auch akustische Analysen, um die Unterscheidungsmerkmale zwischen Husten und Niesen zu identifizieren.

Unsere massenhafte Forschung bietet ein mächtiges Werkzeug, das die Entwicklung zukünftiger Medikamente gegen Husten- und Niesstörungen direkt unterstützen wird. Zu Beginn schneiden Sie eine 28-Gauge-Nadel in eine Kanüle von etwa fünf Millimetern Länge. Mit einer Pinzette und Schleifpapier glätten Sie beide Enden und befestigen Sie ein Ende an einem Silikonschlauch.

Schließen Sie die mit dem Schlauch befestigte Kanüle an eine Ein-Milliliter-Spritze an und spülen Sie die Kanüle mit Wasser, um die Öffnung zu überprüfen. Biegen Sie anschließend die Kanüle in einem 90-Grad-Winkel mit einem Verhältnis von zwei zu drei Armen. Führe den längeren Arm in das fünf Zentimeter lange Silikonrohr.

Teilen Sie die Mäuse zufällig drei Gruppen zu, jeweils sechs Mäuse. Jetzt befestigen Sie die betäubte Maus in Rückenposition auf dem Tisch. Nach dem Rasieren der Schädel- und Halsbehaarung desinfizieren Sie den Bereich mit Iodophor und Alkohol.

Unter dem Mikroskop wird die Halshaut etwa einen Zentimeter eingeschnitten und stumpf durch Gewebe und Muskeln geschnitten, um die Luftröhre freizulegen. Durchstiche das Weichgewebe zwischen Cricoid und Trachealknorpel mit einer 32-Gauge-Nadel. Dann wird mit einer Augenschere eine minimale Trachealöffnung erzeugt.

Führen Sie die silikonummantelte Metallkanüle etwa einen Millimeter in das Tracheallumen ein und sichern Sie die Kanüle-Luftröhren-Verbindung mit einer 7-0-Naht. Schneiden Sie nun etwa einen Zentimeter auf der Kopfhaut ein und tunneln stumpf subkutan vom Hals bis zum Schädel. Führen Sie das Silikonrohr durch den subkutanen Tunnel zum Schädel, befestigen Sie es mit Zahnkleber am Schädel, und nähen Sie dann die Haut.

Nähen Sie den Halswirbelschnitt und lassen Sie das Tier fünf Tage lang erholen. Statten Sie die Ultraschallsonde mit einem portkompatiblen Dichtungsring aus und führen Sie die Sonde in den ganzkörperlichen Plethysmographiekammerport, um einen luftdichten Kontakt zu gewährleisten. Verbinden Sie die Ganzkörper-Plethysmographiekammer mit dem Durchflusssensor und dem Vorspannungsstromsystem.

Befestigen Sie ein mit Totenkopf fixiertes Silikonrohr an ein 30-Zentimeter-Verlängerungsrohr und setzen Sie die Maus in die Plenthysmographiekammer für den ganzen Körper. Verlängern Sie das Rohr durch den oberen Port der Kammer und versiegeln Sie den Port mit Modellierton um das Rohr. Überprüfen Sie die Luftdichtheit, indem Sie prüfen, dass die Spitzen der Atemwellenform innerhalb von vier, plus oder minus zwei liegen.

Schließen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit fünf Millilitern Capsaicinlösung an das Verlängerungsrohr an und montieren Sie sie an die Mikroinjektionspumpe. Positioniere eine Hochgeschwindigkeitskamera zur Kammer. Passen Sie den Kameraabstand und Fokus für eine klare Sicht an und stellen Sie die Abtastrate auf 160 Bilder pro Sekunde ein.

Beginnen Sie nun gleichzeitig mit der Ganzkörperplethysmographie, Ultraschall und Kamerasoftware. Lösen Sie die Pumpe aus, um mit der Capsaicin-Infusion zu beginnen, und notieren Sie 10 Minuten lang Hustenwerte. Bereiten Sie die Tiere und alle für den Eingriff benötigten Materialien vor.

Nach der Betäubung und Vorbereitung der Maus sichern Sie sie in einem stereotaxischen Rahmen. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Iodophor und Alkohol. Schneiden Sie die Haut über Schädel und Nasenbein mit einem Skalpell ein, um das Nasenbein freizulegen.

Mit einem Mikrobohrer wird ein 0,5-Millimeter-Loch an der Verbindung zwischen dem Nasenbein und dem lateralen Fortsatz des Nasenseptumsknorpels erzeugt. Jetzt wird die Nasenschleimhaut durch das Bohrloch freigelegt. Heben Sie vorsichtig die Nasenschleimhaut mit einer 32-Gauge-Nadel an, um die Nasenhöhle freizulegen.

Dann wird das Polyethylenrohr in den stereotaxischen Arm montiert. Richten Sie die Spitze des Rohrs bündig mit der Öffnung des Gratlochs aus, befestigen Sie den Schlauch mit Zahnkleber am Nasenbein und nähen Sie dann die Haut ein. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen und lassen Sie sie sich erholen, bis das Bewusstsein zurückkehrt.

Verbinden Sie die Ganzkörper-Plethysmographiekammer gemäß dem Herstellerhandbuch mit dem Durchflusssensor und dem Vorspannungsstromsystem. Als Nächstes wird die Ultraschallsonde mit einer portadaptierten Dichtung ausgestattet. Führen Sie die Sonde in die Plethysmographiekammer ein und überprüfen Sie eine luftdichte Abdichtung.

Die Maus wird in die Plethysmographiekammer übertragen und das Polyethylenrohr durch den oberen Port verlängert. Versiegeln Sie den Anschluss mit Modellierton, um das Rohr zu sichern. Überprüfen Sie die Luftdichtheit der Kammer und stellen Sie die Kamera wie zuvor gezeigt auf.

Führen Sie schließlich ein 0,25 Millimeter großes Nylonfilament durch ein weiches Rohr in die Nasenhöhle bis zu einer Tiefe von null bis drei Millimetern. Halten Sie fünf Zentimeter des Filaments außerhalb des Handrohrs frei. Während jeder Stimulation drückt man das freie Ende des Filaments, bis es sich auf etwa 45 Grad biegt, wodurch für eine Sekunde etwa 0,6 Gramm Kraft auf die Nasenschleimhaut ausgeübt wird.

Wiederholen Sie die Stimulation alle 30 Sekunden, während Sie die Niesreaktionen für 10 Minuten aufzeichnen. Mäuse, die sich einer Tracheal- oder Nasenoperation mit mechanischer Nasenstimulation und Capsaicin-Tracheal-Herausforderung unterzogen wurden, erhöhten Nies- bzw. Hustenereignisse signifikant. Ganzkörper-Plethysmographie-Aufnahmen zeigten sowohl Einzel- als auch Doppelspitzen-Atemspuren bei capsaicininduziertem Husten und mechanisch induziertem Niesen.

Schalloszillowramme zeigten, dass Hustenaudio zu Beginn eine abrupt einsetzende Spitzenintensität hatte und sich im Bereich von null bis 30 Kilohertz konzentrierte. Während das Niesgeräusch zunehmend in der Intensität zunahm, einen Bereich von null bis 80 Kilohertz umfasste und eine längere Dauer hatte. Die Kompressionsphase bei Single-Peak-Husten lag im Durchschnitt bei etwa 32,39 Millisekunden, deutlich kürzer als Double-Peak-Husten, etwa 53,17 Millisekunden.

Die durchschnittliche Kompressionsphase von Einzelspitzenniesen betrug etwa 44,03 Millisekunden, während Doppelspitzenniesen im Durchschnitt etwa 74,24 Millisekunden betrugen und deutlich länger waren. Einzelne Spitzenmuster traten bei 77,55 % der Husten auf, während nur 32,42 % der Nieser einzelne Spitzen aufwiesen, wobei Doppel-Peak-Muster bei 67,58 % dominierten. Nies-Audio-Dauern waren signifikant länger als Hustenzeiten, allerdings mit überlappenden Bereichen. Die Durchtrennung der nasalen sensorischen Afferenten reduzierte das capsaicininduzierte Niesen signifikant, während das Husten unbeeinträchtigt blieb.