Name: Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Aktin-Co-Sedimentation zur Analyse von Proteinbindungen an F-Aktin in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung spezifischer Wechselwirkungen mit dem dynamischen Aktin-Zytoskelett.

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Wir danken Ihnen, Dr. Praveen Kumar in der Wittman Labor am UCSF für den Film von Aktin in HaCaT-Zellen.

1. Vorbereitung von Aktin Die Quelle von Aktin in diesem Test verwendet wurde non-muscle menschlichen Blutplättchen (β-Aktin) von Zytoskelett Inc. Stock Aliquots bei 10 mg / ml in der -70 ° C Gefrierschrank aufbewahrt erhalten. Für den Test wird die Aktin bis 0,4 mg / ml in einem Puffer, enthaltend 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP und 0,5 mM DTT, bei 20.000 g für 10 Minuten zentrifugiert bei 4 º C verdünnt Der Überstand, der monomeren Aktin ist bereit, polymerisiert werden. Aktin-Polymerisation wird durch Zugabe 50 mM KCl, 1 mM ATP und 2 mM MgCl 2 induziert. Die Polymerisation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 Stunde. 2. Zubereitung von Protein- In diesem Test werden wir die Verwendung des C-Terminus von Talin, die als GST-markierte Protein wurde gereinigt. Das Protein im Assay verwendet werden soll, um eine Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation vor, frei von Aggregaten vor der Inkubation mit F-Aktin unterzogen. Das Protein wird bei 100.000 g in einer Beckman-Ultrazentrifuge für 20 min bei 22 º C gesponnen 3. Aktin-Protein-Inkubation Der Betrag von Aktin und Protein in einem Test variieren. In diesem Beispiel verwenden wir Aktin im Übermaß. Normalerweise wird ein Molverhältnis berechnet, zB. einem 4:1 Molverhältnis von Aktin an Protein. In den folgenden Assay wird die Endreaktionsvolumen 150 pl. Der Puffer, in dem die Protein-und F-Aktin inkubiert wird das Protein getestet werden und auf die notwendigen Voraussetzungen abhängig. In diesem Beispiel verwenden wir einen Puffer mit 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 und 2 mM MgCl 2. Die Protein-und F-Aktin sind in den Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. 4. Sedimentation von F-Aktin Nach der Inkubation werden die Proben bei 100.000 g bei 22 º C gesponnen Wir verwenden einen Beckman Ultrazentrifuge in dem Video. Der Rotor ist vorsichtig, um nicht auf die Pellets stören entfernt. 5. Analyse von Protein-Co-Sedimentation mit F-Aktin Die Überstände werden sorgfältig durch Pipettieren in ein Eppendorf-Röhrchen und 5 X Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer entfernt wird aufgenommen. Eine entsprechende Volumen von 1 X Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer ist es, die Pellets noch hinzu, pipettiert rauf und runter, und in neue Eppendorf-Röhrchen. Die relativen Mengen an Protein in den Pellets und Überstände werden nach ihrer Trennung durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung des Gels oder Western-Blot analysiert. Um die Spezifität der Protein-Interaktion mit Aktin zu bestimmen, Aktin abhängig von ihrer Konzentration co-Ablagerungen durchgeführt werden kann. Für diese Art von Experiment, eine feste Menge des Proteins und eine Reihe von steigenden Mengen an Aktin inkubiert, und die Analyse erfolgt wie oben beschrieben durchgeführt.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Aktin co-Sedimentation ist ein einfaches in vitro-Assay zur specfic Proteine ​​die Bindung an F-Aktin zu analysieren. In diesem Video zeigen wir ein Beispiel, wie eine einfache Aktin co-Sedimentation durchgeführt werden kann. Wir zeigen, wie F-Aktin vorbereiten, bereiten das Protein getestet werden und das Verfahren von Aktin co-Sedimentation. Eine Reihe von Punkten zu beachten bei der Durchführung von Aktin-Co-Sedimentation Assays werden. Zum Beispiel kann der Puffer-Komponenten für die Inkubation je nach Protein getestet und pH-Wert, Temp...

aktin co-sedimentation assay; für die analyse von protein-bindung an f-aktin

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Das Aktin-Zytoskelett in der Zelle ist ein Netzwerk von Aktin-Filamenten, die die Bewegung von Zellen und zelluläre Prozesse ermöglicht, und das erzeugt Spannung und hilft unterhält zelluläre Form. Obwohl das Aktin-Zytoskelett ist eine starre Struktur, es ist eine dynamische Struktur, die ständig Umbau ist. Eine Reihe von Proteinen, um das Aktin-Zytoskelett zu binden. Die Bindung eines bestimmten Proteins zu F-Aktin ist oft erwünscht, zellbiologische Beobachtungen stützen oder besser zu verstehen dynamische Prozesse wegen Umbau des Aktin-Zytoskeletts. Die Aktin-Co-Sedimentation Assay ist ein in-vitro-Test routinemäßig verwendet, um die Bindung spezifischer Proteine ​​oder Proteindomänen mit F-Aktin zu analysieren. Die grundlegenden Prinzipien des Tests beinhalten eine Inkubation des Proteins von Interesse (in voller Länge oder Domäne) mit F-Aktin, Ultrazentrifugationsschritt zu Pellets F-Aktin und Analyse des Proteins co-sedimentiert mit F-Aktin. Aktin co-Sedimentation Assays können entsprechend ausgelegt sein, um Aktin Bindungsaffinitäten und im Wettbewerb Assays messen.

Proteine ​​binden an filamentösen Aktin (F-Aktin) durch verschiedene Aktin-bindende Module. In diesem Video zeigen wir das Verfahren von Aktin co-Sedimentation, die eine in vitro-Assay routinemäßig verwendet, um Proteine ​​oder bestimmte Domänen, die F-Aktin binden zu analysieren.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

Das Aktin-Zytoskelett innerhalb der Zelle ist ein Netzwerk aus Aktinfilamenten, das die Bewegung von Zellen sowie zelluläre Prozesse ermöglicht und ... generiert

Im Inneren der Zelle. Das Aktin-Zytoskelett ist eine dynamische Struktur, und seine Umgestaltung spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Prozessen wie Zellteilung, Zellwanderung und physikalischem Transport. Eine breite Palette von Proteinen kann über spezifische Aktin-bindende Module an das Aktin-Zytoskelett binden.In diesem Video demonstrieren wir die Durchführung einer Aktin-Kosedimentationsanalyse, einem In-vitro-Assay, der routinemäßig zur Untersuchung von Proteinen oder spezifischen Protein-Domänen eingesetzt wird, die an filamentöses Aktin binden. Hallo, ich bin Jody Var aus dem Labor von Dr. Diane Barber am Department für Zell- und Gewebeforschung an der UCSF. In diesem Video zeige ich Ihnen, wie man eine Aktin-Kosedimentationsanalyse durchführt.Dieses Verfahren ist eine Methode, um Proteine zu analysieren, die spezifisch an filamentöses Aktin binden, und kann zur Bestimmung von Bindungsaffinitäten verwendet werden. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Herstellung von Aktinfilamenten und Vorbereitung des zu testenden Proteins, Inkubation des Proteins der Untersuchung mit filamentösem Aktin, kurz f-Aktin, Zentrifugation von f-Aktin mittels Ultrazentrifugation bei hunderttausend × g, SDS-Seite und Coomassie-Blau-Färbung zur Visualisierung der Überstand- und Pellet-Fraktionen.Und schließlich die Analyse des Proteins, das im Plattenbruchteil mit F-Aktin mitpräzipitiert. Beginnen wir also. Um Aktinfilamente herzustellen, ist es eine bewährte Praxis sicherzustellen, dass das verwendete Aktin in monomerer Form vorliegt.Eine Stammlösung von Aktin mit 10 M pro ml wird aus dem minus 80-Gefrierschrank entnommen, und eine Arbeitsverdünnung mit 2,4 mg pro ml wird in einem Puffer hergestellt, der Tris, Calciumchlorid, ATP zur Monomerstabilisierung und DTT enthält. Die Arbeitsverdünnung wird nach einer einstündigen Inkubation auf Eis eine Stunde lang auf Eis gestellt. Die Aktinlösung wird bei vier Grad zehn Minuten lang mit 14.000 U/min zentrifugiert.Das resultierende Überstand wird das monomere Aktin sein. Nun kann aus diesen gereinigten Aktin-Monomeren durch Zugabe von Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid und ATP für eine Stunde bei Raumtemperatur filamentöses Aktin erzeugt werden. Das filamentöse Aktin ist nun bereit, mit dem Protein oder der Protein-Domäne der Wahl zu inkubieren, was wir Ihnen im nächsten Schritt zeigen werden.Um mit dem Aktin-Cosedimentationsassay fortzufahren, müssen wir das zu testende Protein vorbereiten. Heute verwende ich den Klon, der als GSC-Fusionsprotein gereinigt wurde. Das Protein wird durch Ultrazentrifugation von Aggregaten vorgeklärt, und das resultierende Überstand ist nun bereit, im Assay verwendet zu werden.Um die Bindung eines Proteins an Aktin zu testen, muss Aktin im Überschuss vorliegen. In diesem Fall werden 10 Mikrogramm Aktin mit fünf Mikrogramm Protein in einem Puffer, der Tris, ATP, BTE, Captoethanol, ETTA und Calciumchlorid enthält, so vermischt, dass sich ein Gesamtvolumen von 150 Mikrolitern für die Inkubation von Protein und Aktin ergibt. Die Inkubationen werden direkt in Ultrazentrifugenröhrchen eine Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Röhrchen eins und zwei stellen Kontrollen dar. Röhrchen eins enthält nur Aktin in Puffer.Zwei enthält nur Protein in Pufferrohr. Drei enthält sowohl Aktin als auch das CNU von Tailn im Puffer. Vier ist eine zusätzliche Kontrolle für unspezifische Bindung und enthält allein Aktin und GST-Protein. Nach der einstündigen Inkubation werden unsere Proben vorsichtig in den Beckman-Rotor gegeben.Danach stellen wir das Ultrazentrifugengerät auf hunderttausend G und zentrifugieren die Proben 20 Minuten lang bei 22 Grad C. Nach diesem Zentrifugationsschritt konnten wir unsere Proben für die Durchführung von SDS-Page vorbereiten. Nach der 20-minütigen Zentrifugation werden die Proben vorsichtig aus dem Rotor entnommen, wobei darauf geachtet wird, dass das Präzipitat nicht gestört wird. An der Seite des Röhrchens, an der sich das Präzipitat befindet, wird eine Markierung angebracht.Es wird darauf geachtet, das Supinat in Eppendorf-Röhrchen zu überführen, worauf fünf XSCS-Probelösungspuffer hinzugefügt werden. Ein XSCS-Probelösungspuffer wird dem im Ultrazentrifugenröhrchen verbliebenen Pellet hinzugefügt. Nach mehrmaligem Auf- und Abpipettieren wird das resuspendierte Pellet in ein frisches Eppendorf-Röhrchen überführt.Die Proben werden anschließend bis zu 10 Minuten in einem Heizblock gekocht. Nach dem Kochen werden die Proben auf ein SDS-Page-Gel aufgetragen. Hier verwende ich ein bereits vorbereitetes 10 %-Gel.Die Proben werden sorgfältig in der richtigen Reihenfolge in die Gelen geladen. Das Gel wird etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit konstanter Spannung laufen gelassen. Nach Beendigung des Gelauf laufen wir es mit Kumasisierblau, um die Proteine sichtbar zu machen.Die Kumasi-Blau-Lösung sollte das Gel vollständig bedecken. Das Gel wird mindestens 20 Minuten lang in einem Schüttler belassen. Anschließend wird die ESI-Blau-Lösung entfernt und das Gel in Entfärbelösung getaucht.Das Gel wird etwa eine Stunde lang auf einem Schüttler stehengelassen, bis Banden im Gel sichtbar sind. Nach der Kumasi-Färbung kann das Gel analysiert werden, um die relative Menge an Protein in den Überstands- im Vergleich zu den Pellet-Fraktionen zu bestimmen. Wenn man sich das Gel ansieht, das in den Gelen eins und zwei repariert wurde, können wir die Überstand- und Pellet-Fraktionen von Acton allein erkennen.In den Gängen drei und vier befanden sich die Überstand- und Pellet-Fraktionen des alleinigen C teer tailn. In den Gängen fünf und sechs befanden sich die Überstand- und Pellet-Fraktionen der Inkubation von acton und C des tail. In den Gängen sieben und acht hatten wir die Überstand- und Pellet-Fraktionen der Inkubation von Actin und GST-Protein.Wie Sie sehen können, ist die CT des Schwanzes in Spur sechs nur im Palatinfraction sichtbar. Die Ergebnisse dieses Gels deuten auf eine spezifische Bindung des C-Terminus, des Schwanzes, an Aktin hin. In diesem Video haben Sie gesehen, wie man einen Aktin-Co-Sedimentations-Assay durchführt.Actin-Co-Sedimentationsassays sind eine In-vitro-Methode zur Analyse von Aktin-bindenden Proteinen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, folgende Punkte zu beachten: Ihr Protein der Wahl sollte vorbehandelt werden, und für jede Inkubation von Protein und Aktin muss eine negative Kontrolle mit alleinigem Protein eingeschlossen werden.Diese Kontrolle zeigt an, ob sich das vorab geklärte Protein von selbst absetzt, da die Bindung an F-Aktin durch einige Proteine empfindlich gegenüber pH, Temperatur oder Salzkonzentration im Puffer sein kann. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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