Name: Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Aktin-Co-Sedimentation zur Analyse von Proteinbindungen an F-Aktin in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung spezifischer Wechselwirkungen mit dem dynamischen Aktin-Zytoskelett.

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Wir danken Ihnen, Dr. Praveen Kumar in der Wittman Labor am UCSF für den Film von Aktin in HaCaT-Zellen.

1. Vorbereitung von Aktin Die Quelle von Aktin in diesem Test verwendet wurde non-muscle menschlichen Blutplättchen (β-Aktin) von Zytoskelett Inc. Stock Aliquots bei 10 mg / ml in der -70 ° C Gefrierschrank aufbewahrt erhalten. Für den Test wird die Aktin bis 0,4 mg / ml in einem Puffer, enthaltend 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM ATP und 0,5 mM DTT, bei 20.000 g für 10 Minuten zentrifugiert bei 4 º C verdünnt Der Überstand, der monomeren Aktin ist bereit, polymerisiert werden. Aktin-Polymerisation wird durch Zugabe 50 mM KCl, 1 mM ATP und 2 mM MgCl 2 induziert. Die Polymerisation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 Stunde. 2. Zubereitung von Protein- In diesem Test werden wir die Verwendung des C-Terminus von Talin, die als GST-markierte Protein wurde gereinigt. Das Protein im Assay verwendet werden soll, um eine Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation vor, frei von Aggregaten vor der Inkubation mit F-Aktin unterzogen. Das Protein wird bei 100.000 g in einer Beckman-Ultrazentrifuge für 20 min bei 22 º C gesponnen 3. Aktin-Protein-Inkubation Der Betrag von Aktin und Protein in einem Test variieren. In diesem Beispiel verwenden wir Aktin im Übermaß. Normalerweise wird ein Molverhältnis berechnet, zB. einem 4:1 Molverhältnis von Aktin an Protein. In den folgenden Assay wird die Endreaktionsvolumen 150 pl. Der Puffer, in dem die Protein-und F-Aktin inkubiert wird das Protein getestet werden und auf die notwendigen Voraussetzungen abhängig. In diesem Beispiel verwenden wir einen Puffer mit 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 und 2 mM MgCl 2. Die Protein-und F-Aktin sind in den Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. 4. Sedimentation von F-Aktin Nach der Inkubation werden die Proben bei 100.000 g bei 22 º C gesponnen Wir verwenden einen Beckman Ultrazentrifuge in dem Video. Der Rotor ist vorsichtig, um nicht auf die Pellets stören entfernt. 5. Analyse von Protein-Co-Sedimentation mit F-Aktin Die Überstände werden sorgfältig durch Pipettieren in ein Eppendorf-Röhrchen und 5 X Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer entfernt wird aufgenommen. Eine entsprechende Volumen von 1 X Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer ist es, die Pellets noch hinzu, pipettiert rauf und runter, und in neue Eppendorf-Röhrchen. Die relativen Mengen an Protein in den Pellets und Überstände werden nach ihrer Trennung durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung des Gels oder Western-Blot analysiert. Um die Spezifität der Protein-Interaktion mit Aktin zu bestimmen, Aktin abhängig von ihrer Konzentration co-Ablagerungen durchgeführt werden kann. Für diese Art von Experiment, eine feste Menge des Proteins und eine Reihe von steigenden Mengen an Aktin inkubiert, und die Analyse erfolgt wie oben beschrieben durchgeführt.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Aktin co-Sedimentation ist ein einfaches in vitro-Assay zur specfic Proteine ​​die Bindung an F-Aktin zu analysieren. In diesem Video zeigen wir ein Beispiel, wie eine einfache Aktin co-Sedimentation durchgeführt werden kann. Wir zeigen, wie F-Aktin vorbereiten, bereiten das Protein getestet werden und das Verfahren von Aktin co-Sedimentation. Eine Reihe von Punkten zu beachten bei der Durchführung von Aktin-Co-Sedimentation Assays werden. Zum Beispiel kann der Puffer-Komponenten für die Inkubation je nach Protein getestet und pH-Wert, Temp...

aktin co-sedimentation assay; für die analyse von protein-bindung an f-aktin

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Das Aktin-Zytoskelett in der Zelle ist ein Netzwerk von Aktin-Filamenten, die die Bewegung von Zellen und zelluläre Prozesse ermöglicht, und das erzeugt Spannung und hilft unterhält zelluläre Form. Obwohl das Aktin-Zytoskelett ist eine starre Struktur, es ist eine dynamische Struktur, die ständig Umbau ist. Eine Reihe von Proteinen, um das Aktin-Zytoskelett zu binden. Die Bindung eines bestimmten Proteins zu F-Aktin ist oft erwünscht, zellbiologische Beobachtungen stützen oder besser zu verstehen dynamische Prozesse wegen Umbau des Aktin-Zytoskeletts. Die Aktin-Co-Sedimentation Assay ist ein in-vitro-Test routinemäßig verwendet, um die Bindung spezifischer Proteine ​​oder Proteindomänen mit F-Aktin zu analysieren. Die grundlegenden Prinzipien des Tests beinhalten eine Inkubation des Proteins von Interesse (in voller Länge oder Domäne) mit F-Aktin, Ultrazentrifugationsschritt zu Pellets F-Aktin und Analyse des Proteins co-sedimentiert mit F-Aktin. Aktin co-Sedimentation Assays können entsprechend ausgelegt sein, um Aktin Bindungsaffinitäten und im Wettbewerb Assays messen.

Proteine ​​binden an filamentösen Aktin (F-Aktin) durch verschiedene Aktin-bindende Module. In diesem Video zeigen wir das Verfahren von Aktin co-Sedimentation, die eine in vitro-Assay routinemäßig verwendet, um Proteine ​​oder bestimmte Domänen, die F-Aktin binden zu analysieren.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

Das Aktin-Zytoskelett innerhalb der Zelle ist ein Netzwerk aus Aktinfilamenten, das die Bewegung von Zellen sowie zelluläre Prozesse ermöglicht und ... generiert

Im Inneren der Zelle. Das Aktin-Zytoskelett ist eine dynamische Struktur, und seine Umgestaltung spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Prozessen wie Zellteilung, Zellwanderung und physikalischem Transport. Eine breite Palette von Proteinen kann über spezifische Aktin-bindende Module an das Aktin-Zytoskelett binden.In diesem Video demonstrieren wir die Durchführung einer Aktin-Kosedimentationsanalyse, einem In-vitro-Assay, der routinemäßig zur Untersuchung von Proteinen oder spezifischen Protein-Domänen eingesetzt wird, die an filamentöses Aktin binden. Hallo, ich bin Jody Var aus dem Labor von Dr. Diane Barber am Department für Zell- und Gewebeforschung an der UCSF. In diesem Video zeige ich Ihnen, wie man eine Aktin-Kosedimentationsanalyse durchführt.Dieses Verfahren ist eine Methode, um Proteine zu analysieren, die spezifisch an filamentöses Aktin binden, und kann zur Bestimmung von Bindungsaffinitäten verwendet werden. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Herstellung von Aktinfilamenten und Vorbereitung des zu testenden Proteins, Inkubation des Proteins der Untersuchung mit filamentösem Aktin, kurz f-Aktin, Zentrifugation von f-Aktin mittels Ultrazentrifugat

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Forschung

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Biologie

Wir wenden label-free-Protein-Interaktion Analyse mittels Biacore X100 für Struktur-Funktions-Analyse der Bindung von mehreren Cystatin B-Mutanten durch kinetische Charakterisierung Papain. Calibration-free-Konzentration Analyse (EUFA) misst die Konzentration des Proteins mit behielt bindende Aktivität, ohne die Notwendigkeit für eine Standard-Kurve. Wir zeigen, dass die Bestätigung der Konzentrationen mit EUFA erhöht die Zuverlässigkeit der kinetischen Analyse und die kinetischen Konstanten...

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

Polymerisation von FtsZ ist für bakterielle Zellteilung. In diesem Bericht haben wir ausführlich einfache Protokolle zu FtsZ Polymerisation Aktivitäten zu überwachen und zu diskutieren den Einfluss der Pufferzusammensetzung. Die Protokolle können verwendet werden, um die Wechselwirkung von FtsZ mit regulatorischen Proteinen oder antibakterielle Medikamente, die Polymerisation beeinträchtigen FtsZ untersuchen.

FtsZ Polymerisation Assays: Einfache Protokolle und Überlegungen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit filamentösem Actin (F-Aktin) zu coedimieren und, falls die Bindung beobachtet wird, die Affinität der Wechselwirkung zu messen.

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Frühen Endosom Funktionen hängen F-Aktin-Polymerisation. Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu biochemischen und genetischen Manipulationen.

In-vitro- Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomen

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Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Um voranzukommen, müssen Wachstumskegel Zugkräfte gegen die äußere Umgebung ausüben. Die Erzeugung von Zugkräften ist abhängig von der Aktindynamik und der Kupplungskupplung. Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zur Analyse der Aktindynamik, der Kupplungskupplung und der Zugkräfte für den Wachstumskegelvorschub.

Analysen von Aktindynamik, Kupplungskupplung und Zugkraft für den Wachstumskegelvorschub

Wir präsentieren Protokolle für einfache mikrofluidische Aktinfilament-Assays in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie, die es ermöglichen, einzelne Aktinfilamente in Echtzeit genau zu überwachen und sie nacheinander verschiedenen Proteinlösungen auszusetzen.

Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aktinkometen auf den Oberflächen von Perlen mit kommerziell erhältlichen Proteinbestandteilen hergestellt werden können. Solche Systeme ahmen die hervorstehenden Strukturen in Zellen nach und können verwendet werden, um physiologische Mechanismen der Kraftproduktion auf vereinfachte Weise zu untersuchen.

Rekonstitution der Aktin-basierten Motilität mit kommerziell erhältlichen Proteinen

Diese Methode beschreibt einen lektinbasierten in vitro Sedimentationsassay zur Quantifizierung der Bindungsaffinität von Glucanphosphatase und Amylopektin. Dieser Co-Sedimentations-Assay ist zuverlässig für die Messung der Glucan-Phosphatase-Substratbindung und kann auf verschiedene solubilisierte Glucan-Substrate angewendet werden.

Concanavalin A-basierter Sedimentationsassay zur Messung der Substratbindung von Glucanphosphatasen

Erfahren Sie die Aktin-Co-Sedimentation zur Analyse von Proteinbindungen an F-Aktin in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung spezifischer Wechselwirkungen mit dem dynamischen Aktin-Zytoskelett.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

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