Visualisierung des Torwächters: Evans auf blauem Farbstoff basierende Bewertung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke bei erwachsenen Zebrafischen

Diese Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung einer zuverlässigen, einfachen und kostengünstigen Methode zur Beurteilung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke bei erwachsenen Zebrafischen. Die meisten Zebrafischstudien haben keine einfache, zuverlässige Methode, um die Störung der Blut-Hirn-Schranke zu messen, und die bestehenden Methoden sind oft komplex oder kostspielig. Dieses Protokoll bietet also eine praktische und erschwingliche Lösung.

Dieses Protokoll ist einfach, kostengünstig und kombiniert sowohl visuelle als auch messbare Analysen, ohne dass teure Geräte oder komplizierte Schritte erforderlich sind. Durch die Bereitstellung eines einfachen, reproduzierbaren Protokolls wird es für Labore einfacher sein, neurovaskuläre Veränderungen in erwachsenen Zebrafisch-Krankheitsmodellen zu untersuchen. Betäuben Sie den Zebrafisch zu Beginn, indem Sie die Wassertemperatur schrittweise von 12 Grad Celsius auf sieben Grad Celsius senken, bis der Fisch nicht mehr auf taktile Reize reagiert.

Injizieren Sie mit einer 31-Gauge-Insulinspritze 20 Mikroliter 1%Evans-Blau oder EB-Farbstoff in die intraperitoneale Höhle des Fisches und üben Sie 10 Sekunden lang sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um einen Rückfluss zu verhindern. Setzen Sie den Fisch nun in ein Auffangbecken um und lassen Sie ihn 30 Minuten lang erholen. Überwachen Sie die Fische während dieser Zeit auf Verletzungen, Sterblichkeit oder Verhaltensänderungen.

Um eine Positivkontrolle zu etablieren, bereiten Sie eine sterile 31-Gauge-Nadel vor, die an einer Insulinspritze befestigt ist, um eine Stichwundverletzung durchzuführen. Nach einer 30-minütigen Erholungsphase betäuben Sie den Fisch erneut, wie bereits gezeigt. Positioniere den Fisch aufrecht auf einer flachen, kalten Oberfläche, z. B. einer Eisgelpackung.

Führen Sie die Nadel in einem 90-Grad-Winkel bis zu einer Tiefe von nicht mehr als 1,5 Millimetern in eine Seite des Cephalons ein. Setzen Sie den Fisch dann in ein Auffangbecken um und lassen Sie ihn 30 Minuten lang erholen. Nachdem Sie den Fisch durch Unterkühlung eingeschläfert haben, verwenden Sie eine sterile Klinge oder eine chirurgische Schere, um den eingeschläferten Fisch zu enthaupten.

Spülen Sie den Kopf zweimal in 1X PBS mit einem Verhältnis von Fisch zu PBS von 1:20 ab, um überschüssiges Blut und Evansblau-Farbstoff zu entfernen. Fixieren Sie dann den Kopf in 4%-Paraformaldehyd mit einem Verhältnis von Fisch zu Fixiermittel von 1:20 und inkubieren Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius. Legen Sie den fixierten Kopf in eine saubere Petrischale und sezieren Sie das Gehirn mit einer spitzen Pinzette.

Fügen Sie während der Dissektion kontinuierlich PBS tropfenweise hinzu, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen und ein Austrocknen zu verhindern. Spülen Sie das präparierte Gehirn zweimal in zwei separaten PBS-Bädern und legen Sie das Gewebe auf eine 1%Agarose-Platte, um die Feuchtigkeit zu speichern und ein Schrumpfen zu verhindern. Beobachten Sie das präparierte Hirngewebe unter einem Stereomikroskop.

Um mit der quantitativen Analyse zu beginnen, laden Sie die Fidschi-Software herunter, installieren Sie sie und öffnen Sie die Gehirnbilddatei in Fidschi. Führen Sie eine Farbentfaltung durch, indem Sie Bild auswählen, gefolgt von Farbe, Farbentfaltung und RGB. Dies führt zu drei separaten Bildern, die Rot-, Grün- und Blautöne darstellen.

Aktivieren Sie nun das Blaukanalbild, das normalerweise mit Farbe 3 beschriftet ist, indem Sie auf das Bild klicken. Konvertieren Sie es in 8-Bit-Graustufen, indem Sie Bild auswählen, gefolgt von Typ und 8-Bit. Um als Nächstes die Grauintensität des 8-Bit-Bildes zu messen, legen Sie die Messparameter fest, indem Sie Analysieren und Messungen einstellen auswählen.

Wählen Sie dann den Bereich und den mittleren Grauwert aus. Zeichnen Sie mit dem Rechteckauswahlwerkzeug einen einheitlich großen Interessenbereich und messen Sie die Grauintensität, indem Sie "Analysieren" und dann "Messen" auswählen. Normaler Zebrafisch zeigte einen typischen bräunlichen Hautton, und der EB-injizierte Zebrafisch zeigte einen auffälligen bläulichen Farbton.

Um die Integrität der Blut-Hirn-Schranke im adulten Zebrafisch-Parkinson-Modell zu untersuchen, wurde die EB-Farbstoff-Extravasation in das Hirngewebe zwischen der mit Kochsalzlösung injizierten Kontrolle und dem Parkinson-Zebrafisch verglichen. In der negativen Kontrollgruppe erschienen die Blutgefäße im Gehirn rötlich, was auf das Fehlen einer EB-Farbstoff-Extravasation hinweist. Im Gegensatz dazu zeigten die mit Kochsalzlösung injizierte Kontrollgruppe, die Positivkontrolle und die Parkinson-Gruppe eine bläuliche Färbung in den Hirngefäßen, was eine erfolgreiche systemische Zirkulation des EB-Farbstoffs bestätigt.

Präparierte Gehirne aus der negativen Kontrollgruppe erschienen weißlich mit deutlich sichtbaren Blutgefäßen, was das Fehlen einer EB-Färbung bestätigte. In der Positivkontroll-Verletzungsgruppe deutete eine intensive blaue Färbung um das Hirngewebe auf einen Farbstoffaustritt aufgrund einer absichtlichen Störung der Blut-Hirn-Schranke hin. In der Gruppe, in die Kochsalzlösung injiziert wurde, blieb die EB-Färbung auf die Blutgefäße beschränkt, was auf eine intakte Blut-Hirn-Schranke hindeutet.

Die Parkinson-Gruppe zeigte ein dunkleres, diffuseres blaues Färbemuster, was auf einen signifikanten EB-Farbstoffaustritt und eine Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke hinweist. Die quantitative Graustufenanalyse ergab signifikant niedrigere Grauintensitätswerte in der Parkinson-Gruppe im Vergleich zur Gruppe mit Kochsalzlösung.