Bewertung von Blattantworten auf mikrobielle Sekundärmetabolite mittels eines Hochdurchsatzformats

Mein Labor arbeitet an Interaktionen von Pflanzenmikroben mit dem ultimativen Ziel, die Resistenz von Robbenpflanzen mithilfe von Genetik zu verbessern. Jüngste Entwicklungen haben gezeigt, dass mikrobielle Sekundärmetaboliten eine Schlüsselrolle bei der Förderung der Anfälligkeit oder Resistenz von Pflanzen spielen. Zu Beginn verwenden Sie eine Korkbohrung mit vier Millimeter Durchmesser, um pro Pflanze drei Blattscheiben aufzufangen und dabei die Mittelvene zu vermeiden.

Mit dem scharfen Ende sollte man eine Drehbewegung ausüben, um das Zerbrechen des Gewebes zu verhindern. Fügen Sie sekundäre Metaboliten oder Lösungsmittelbehandlungen in der gewünschten Konzentration in einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte ein, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen. Legen Sie die Blattscheiben vorsichtig in die Brunnen.

Setzen Sie die 96-Well-Platte mit abgenommenem Deckel in ein Glasglockenglas, das mit einer Vakuumdüse ausgestattet ist. Dann befestigen Sie den Vakuumschlauch an die Glasglockendüse und stellen Sie den Vakuumdruck für 10 Sekunden bei 9,8 Pfund pro Quadratzoll ein. Schalte den Vakuum aus und lasse den Druck langsam über 10 Sekunden ab, und wiederhole dann den Vakuumzyklus.

Setzen Sie den Deckel nun wieder auf die 96-Well-Platte und inkubieren Sie ihn auf einem Orbitalshaker unter einer Lichtquelle. Positioniere dich vier Stunden lang 23 Zentimeter über dem Shaker. Wasche die Sonde mit ultrareinem Wasser und tupfe sie leicht mit einem fusselfreien Tuch zum Trocknen.

Beachten Sie die Leitfähigkeitsmessung des Wassers für die spätere Referenz. Zwischen vier bis sechs Stunden nach der Behandlung wird die Leitfähigkeit in einzelnen Bohrlöchern gemessen und erfasst, indem die Sonde in die Flüssigkeit um die Blattscheibe eintaucht. Halten Sie die Platte in einem 45-Grad-Winkel, um sicherzustellen, dass die Sonde vollständig eingetaucht ist.

Nach dem Spülen der Sonde wird früher demonstriert, gelegentlich wird die Leitfähigkeit des Wassers getestet, um die Stabilität der Sonde zu bestätigen. Anschließend wird eine Kunststoffdeckenfolie über die 96-Well-Platte gelegt und für die Übernachtung wieder in den orbitalen Shaker zurückgegeben. Zur Herstellung des Peroxidasesubstrats erhitzen Sie 40 Milliliter destilliertes steriles Wasser auf 70 Grad Celsius in einem Becher mit einem Rührstiel.

Lösen Sie 50 Milligramm von fünf Aminosalicylsäuren in erhitztem Wasser auf. Dann fügen Sie zusätzliches Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 50 Milliliter zu bringen, und stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid auf sechs ein. Schützen Sie die lichtempfindliche Lösung, indem Sie den Behälter mit Alufolie abdecken.

In einem 50-Milliliter-Bernstein-Kegelrohr bereiten Sie eine 1%-Wasserstoffperoxidlösung in ultrareinem Wasser vor. Dann werden 10 Mikroliter der 1%-Wasserstoffperoxidlösung pro Milliliter der fünf Aminosalicylsäurelösungen hinzugefügt, die zur Herstellung des Prüfmediums benötigt werden. Zum gewünschten Zeitpunkt wird fünfmal vermischt und dann 50 Mikroliter aus jedem Bohrloch der Probenplatte auf eine neue Platte übertragen.

Fügen Sie 50 Mikroliter des Prüfmediums hinzu und inkubieren Sie drei Minuten bei Raumtemperatur. Um die Reaktion zu stoppen, geben Sie jedem Bohrloch 20 Mikroliter von zwei normalen Natriumhydroxidden hinzu und verwenden Sie einen Plattenmesser, um die Absorptionsfähigkeit jedes Bohrlochs bei 595 Nanometern zu messen. Wasser und 0,1 % Dimethylsulfoxid erzeugten ähnliche Ionenaustritte und Peroxidase-Aktivitätsniveaus, was ihre Verwendung als Negativkontrolle bestätigte.

Die Behandlung mit einem mikromolaren FLG 22 induzierte signifikant Ionenleck, Peroxidase-Aktivität und Callose-Produktion, was bestätigte, dass es eine robuste positive Kontrolle ist. Die Gramillinbehandlung induzierte erhebliche Ionenverluste und Calloseproduktion, hatte jedoch unterschiedliche Auswirkungen auf die Peroxidase-Aktivität. Surfakt bei 10 Mikromolaren induzierte sowohl die Peroxidase-Aktivität als auch die Callose-Produktion, während die Ionenleckage unverändert blieb.

Die T-2-Toxinbehandlung unterdrückte die Peroxidase-Aktivität, induzierte die Calloseproduktion und hatte keinen Einfluss auf die Ionenlecks. Unser Hydro-Assay ermöglicht es Forschern, drei verschiedene Stressreaktionen in derselben Probe zu beproben, was es den Forschern ermöglicht, begrenzte Mengen mikrobieller Sekundärmetaboliten optimal zu nutzen. Die Möglichkeit, 96 Proben auf derselben Platte zu vergleichen, ermöglicht es Forschern, populationsgenetische Screens oder Systembiologie durchzuführen, um die Interaktionen zwischen Pflanzenmikroben und Pflanzenmikroben zu verstehen.

Meine Forschung konzentriert sich weiterhin auf die Interaktionen von Pflanzenmikroben und die Charakterisierung der Pflanzengene, die wir nutzen können, um Krankheitsresistenz in Getreidepflanzen zu entwickeln.