Messung der Einzelzellalterung mit einem bildgebenden Biomarker von Chromatin und epigenetischer Alterung

Wir entwickelten bildgebungsbasierte Chromatin- und epigenetische Altersbilder, eine neuartige Technik, die Alterung und Verjüngung bei Einzelzellauflösung quantifizieren soll. DNA-Methylierungsuhren schätzen das biologische Alter, sind jedoch auf lineare Regression angewiesen, benötigen große Kohorten und zerstören Proben, was sie kostspielig und ungeeignet für groß angelegte oder longitudinale Studien macht. Zu Beginn übergeben Sie die gefrorenen Organe und Gewebe in einen vorgekühlten Mörser, der über Trockeneis gelegt wird.

Gießen Sie flüssigen Stickstoff über das gefrorene Gewebe und mahlen Sie es gründlich mit einem vorgekühlten Stößel, bis ein gleichmäßig feines Pulver entsteht. Mit einem vorgekühlten Metallspatel wird das gemahlene Gewebe in mehrere Röhrchen verteilt. Nach der Extraktion der Kerne mischen Sie sie mit Trypan-Blau im gleichen Verhältnis in einem separaten Rohr.

Übertragen Sie 10 Mikroliter der Mischung auf ein Hämozytometer oder laden Sie es in einen automatisierten Zellzähler. Geben Sie alle Metadaten, einschließlich Proben-IDs, Bedingungen und Biomarker, in der Kennzeichenkarte ein und exportieren Sie eine CSV-Datei. Geben Sie nun 10.000 Kerne pro Bohrloch in einem 20- bis 30-Mikroliter-Volumen in eine 384-Bohrloch-Platte ab.

Zentrifugiere die Platte bei 1000 g, mit Beschleunigungseinstellung neun und Verzögerungseinstellung vier, für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend fixieren Sie die Zellkerne, indem Sie ein gleiches Volumen von 8 % Paraformaldehyd und PBS hinzufügen, und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen des Fixativs geben Sie 30 Mikroliter 0,1 Molarglycin in PBS und inkubieren Sie es fünf Minuten bei Zimmertemperatur.

Entferne die Glycinlösung und wasche die Brunnen zweimal mit 100 Mikrolitern PBS. Entfernen Sie das PBS aus jedem Brunnen und fügen Sie 30 Mikroliter Blocklösung mit 2 % BSA und 0,5 % Triton X-100 in PBS hinzu. Inkubiere den Teller eine Stunde lang bei Zimmertemperatur.

Nach Entfernung der Blocklösung wird die Probe mit 25 Mikrolitern primärer Antikörperlösung bei vier Grad Celsius inkubiert. Waschen Sie anschließend die Brunnen dreimal mit 100 Mikrolitern PBS, wobei jede Wäsche drei Minuten bei Raumtemperatur dauert. Fügen Sie 25 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Anschließend werden die Brunnen dreimal mit 100 Mikrolitern PBS gewaschen, wobei jeder Wasch drei Minuten bei Raumtemperatur dauert. Färben Sie die Kerne mit DAPI oder Hoechst, indem Sie 30 Mikroliter des Farbstoffs mit einer Konzentration von 0,01 Milligramm pro Milliliter hinzufügen und die Platte einmal mit 100 Mikrolitern PBS waschen, um überschüssige Farbe zu entfernen. Lade die Workflow-Skripte aus dem GitHub-Repository herunter.

Sobald der Download abgeschlossen ist, entpacken Sie die Datei, um ihren Inhalt zu extrahieren. Organisiere das geklonte Bildrepository so, dass die Ordnerstruktur dem vom Workflow übernommenen Format für die korrekte Skriptausführung entspricht. Dann öffne die Terminal-Anwendung, wenn du unter Linux oder Mac OS arbeitest, oder die WSL-Anwendung, wenn du Windows nutzt.

Ändern Sie das Arbeitsverzeichnis in den geklonten Repository-Ordner, indem Sie den erforderlichen Befehl im Terminal eingeben und Enter drücken. Erstellen Sie eine neue Rechenumgebung namens Image_workflow mit Conda und Python Version 3.10 und drücken Sie Enter. Aktivieren Sie die neu erstellte Conda-Umgebung mit dem Befehl conda activate Image_workflow.

Installiere Poetry, einen Python-Paketmanager, in der aktivierten Umgebung mit dem PIP-Installer. Dann installiere alle erforderlichen Python-Pakete, die für den Workflow erforderlich sind, mit Poetry. Konfigurieren Sie nun CUDA innerhalb der Conda-Umgebung so, dass die Funktionalität der Grafikverarbeitungseinheit während des Segmentierungsschritts aktiviert wird.

Öffne die Terminal-Anwendung und ändere den Ordner zum geklonten. Aktivieren Sie die Conda-Umgebung, indem Sie den untenstehenden Befehl eingeben und Enter drücken. Öffnen Sie die Hauptdatei des Workflows in einem Code- oder Texteditor wie VS Code oder Notepad, um die Analyseparameter zu konfigurieren.

Setzen Sie den Projektnamen, indem Sie die Variable p einer kurzen Dateisystem-Safe-Kennung zuweisen, die zur Organisation von Ausgaben verwendet wird. Setze die Liste der Kanäle für die Feature-Extraktion in CHS, einschließlich des Segmentierungskanals, falls Features aus diesem Kanal benötigt werden. Mit ImageIndex und dem Kanallabel als Schlüssel werden die Bildkanal-Identifikatoren von Dateinamen auf die zuvor gespeicherte hochgeschriebene Spaltenüberschrift der Plattenkarte zugeordnet.

Dann setze du Datenstandorte, indem du orgDataLoadPath der Datensatzroute zuweist, orgDataSubfolder dem Bildunterordner bei Bedarf und resultsSavePath der Ausgaberoute. Bestätigen Sie die Dateiendung in imageFileFormat. Bearbeite dann imageFileRegEx, um Python-benannte Capture-Groups für die erforderlichen Teile zu verwenden, einschließlich Zeile, Spalte, Feld, Z-Position und Kanal.

Stellen Sie nun den Segmentierungskanal in segmentation_ch auf den nuklearen Kanal ein, der für die Objekterkennung verwendet wird. Entscheiden Sie, ob Sie die Beleuchtungskorrektur verwenden möchten, indem Sie eine illumiCorrection setzen und auf true setzen, um grundlegende Modelle zu berechnen und anzuwenden. Dann wird die physische Voxelgröße in Mikrometern in voxel_dim als ZYX mit Mikroskopmetadaten eingestellt.

Speichere die Datei und schließe den Editor, nachdem du jeden Parameter überprüft hast. Führen Sie schließlich das Workflow-Skript aus, um Bildauslesungen zu erhalten und eine Validierung durchzuführen, wobei das Terminal während der Ausführung des Skripts offen bleibt. Visualisiere die Ergebnisse und exportiere rohe Bildauslesungen für zusätzliche Analysen in externer Software.

Repräsentative Bilder induzierter pluripotenter Stammzellen zeigten klar getrennte Zellkerne, gefärbt mit DAPI, trimethyliertes Histon H3 bei Lysin 27 und acetyliertes Histon H3 bei Lysin 27. Die Bildanalyse der Leber- und Skelettmuskulatur zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen jungen und alten Proben, wobei alte OSKM-Mäuse im Vergleich zu alten ein reduziertes Bild zeigten, was auf eine teilweise Umprogrammierung hinweist. Die Analyse einzelner Tiere zeigte, dass einige alte OSKM-Proben im Vergleich zu alten Mäusen deutlich reduzierte Bildwerte aufwiesen.

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, altersbedingte Veränderungen in Chromatin und epigenetischer Organisation mit einer einzelnen Zellauflösung über verschiedene Zelltypen und Gewebe hinweg zu untersuchen. Unsere bildgebende Methode ist zerstörerfrei, erhält die Chromatinstruktur, ermöglicht wiederholte Messungen und ist in groß angelegten oder longitudinalen Studien kosteneffektiver. Zukünftige Forschung wird sich darauf konzentrieren, mehr epigenetische Marker hinzuzufügen und alternsbedingte, intranukleare Strukturen zu untersuchen.