Erzeugung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten planaren haartragenden Hautorganoiden unter Verwendung eines Luft-Flüssig-Grenzflächenkultursystems
17. Oktober 2025
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hautorganoiden, die Haarfollikel aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen enthalten, unter Verwendung eines planaren, physiologisch relevanten Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultursystems, um die Hautarchitektur und -funktion zu replizieren.
Der Umfang meiner Forschung ist es, ein UVB-induziertes Schadensmodell zu entwickeln, damit ich die Pathogenität einer seltenen Krankheit, Xeroderma pigmentosum, oder genauer gesagt, XPA, untersuchen kann. Eine der Herausforderungen bei diesen In-vitro-Modellen ist, dass die Kultur ziemlich lange dauert, etwa vier Monate, und da es noch ein recht junges Feld ist, müssen wir sie noch etwas besser charakterisieren. Die Vorteile dieses Modells, wie das von hiPSC abgeleitete 3D-Modell, die Kultur, dass die Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle die menschliche Hautarchitektur rekultikuliert und Hautanhängsel wie Talgdrüse und Haarfollikel besitzt.
Zu Beginn bereiten Sie eine einmolare Lösung vor, indem Sie Natriumhydroxidpellets in ein leeres 15-Milliliter-Rohr geben. Gib destilliertes Wasser zu den Pellets und wirbel das Rohr vortex, um die Pellets aufzulösen. Filtersterilisieren Sie 0,1 molare Natriumhydroxidlösung mit einem 0,2 Mikrometer großen Membranfilter.
Auf Eis verdünnen Sie Kollagen-Typ-I-Lösung mit 10-fachem PBS, fünf-millimolarem Natriumhydroxid und destilliertem Wasser, um das Endvolumen anzupassen. Verteilt 150 Mikroliter dieser Kollagenlösung auf jeden Insert, der in eine Standardplatte mit 12 Wellen gelegt wird. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, damit das Kollagengel polymerisieren kann.
Als Nächstes schneiden Sie P1000-Spitzen mit einem erhitzten Skalpell, um breite Bohrspitzen zu erzeugen. Dann verwenden Sie die breiten Öffnungsspitzen, um eine ausgewählte zystische Struktur mit einer kleinen Menge Medium auf den Deckel einer 10 Zentimeter großen Petrischale zu legen. Entfernen Sie sorgfältig alle Nebenprodukte der Struktur mit einem sterilen Skalpell und stabilisieren Sie sie mit sterilen Pinzetten auf der gegenüberliegenden Seite.
Entfernen Sie etwa einen Millimeter von beiden Enden eines zystischen Hautorganoids neben dem ersten Schnitt mit einem Skalpell. Mit steriler Pinzette entfalten Sie vorsichtig die obere Hautschicht. Schneide das Gewebe je nach Größe in zwei bis vier Stücke.
Dann bewegst du mit steriler Pinzette jedes Stück auf einen kollagenbeschichteten Einsatz, wobei die Epidermis nach oben zeigt. Fügen Sie 600 Mikroliter OMM zu jedem Brunnen einer Standardplatte mit 12 Bohrlöchern hinzu. Übertrage den Einsatz zurück auf die 12-Well-Platte mit OMM.
Dann wird die Platte in einen 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid gelegt. Ein einzelnes, dichtes zelluläres Aggregat, das den Großteil der Zellen umfasst, wurde bis zum Nulltag durch sorgfältige Handhabung und Zentrifugation gebildet. Eine korrekte Induktion der Oberflächenepiderm führte dazu, dass sich am dritten Tag ein dünnes, klares Epithel auf der äußeren Schicht des Aggregats bildete. Bis zum 12. Tag hatte sich an einem Pol der Zyste eine dünne Schicht mesenchymaler Zellen angesammelt.
Haarplacoden und -stifte wurden zwischen Tag 50 und 80 sichtbar, nach der epithelialen und mesenchymalen Ko-Induktion. Organoide ohne sichtbare Placodes zeigten extrem dünnes Epithel und wurden vom planaren Übergang ausgeschlossen. Für die Erzeugung von planaren Hautorganoiden wurden nur Zysten mit mindestens fünf Millimeter Durchmesser und polarisierten Nebenprodukten ausgewählt.
Die Haarfollikel verlängerten sich während der 27 Tage der Luft-Flüssigkeits-Interface-Kultur. Talgdrüsen wurden um Tag 14 in der planaren Konfiguration sichtbar. Die Pigmentierung der Organoide nahm im Laufe der Zeit allmählich zu.
Die Färbung von Hämatoxylin und Eosin zeigte ein geschichtetes Epithel und eine Basalmembran, die es von der Dermis trennten. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte eine hautähnliche Struktur des Menschen in planaren Hautorganoiden.
Übersicht
Diese Studie entwickelt ein UVB-induziertes Schädigungsmodell zur Untersuchung des Xeroderma pigmentosum unter besonderer Berücksichtigung der Erzeugung von Hautorganoiden mit Haarfollikeln aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen. Die Organoiden werden unter Verwendung einer physiologisch relevanten Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert, um die Architektur und Funktion der menschlichen Haut effektiv nachzuahmen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Pathogenität von Xeroderma pigmentosum
- Entwicklung von in-vitro-Hautmodellen
- Anwendung der dreidimensionalen Organoid-Technologie
Hintergrund
- Herausforderungen bei der Kultivierung von Hautorganoiden
- Aktueller Kenntnisstand der Hautbiologie
- Bedeutung von Haarfollikeln und Hautanhangsgebilden in der Forschung
Verwendete Methoden
- Kultur an der Luft-Flüssig-Grenzfläche zur Organoide-Entwicklung
- Menschliche induzierte pluripotente Stammzellen als Ausgangsmaterial
- Immunfluoreszenz- und histologische Färbungstechniken
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung von Hautorganoiden mit Haarfollikeln
- Beobachtung der ko-induktiven Entwicklung von epidermalem und mesenchymalem Gewebe
- Bestätigung einer menschenähnlichen Hautarchitektur mittels Färbung
Schlussfolgerungen
- Diese Studie liefert Einblicke in die Entwicklung von Hautorganoiden aus Stammzellen.
- Zeigt das Potenzial dieses Modells für das Verständnis von Hauterkrankungen auf.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Aus humanen iPSCs stammende, planare, haartragende Haut-Organoiden, die an der Luft-Flüssig-Grenzfläche kultiviert werden, stellen ein physiologisch relevantes in-vitro-System zur Erforschung der Hautbiologie und der Bildung von Anhängen dar. Diese Plattform ermöglicht die vorhersagende Modellierung von Gewebereaktionen auf umweltbedingte Noxen und pharmakologische Substanzen und unterstützt damit die translationale Forschung sowie die mechanistische Risikominimierung in der dermatologischen Forschung und Entwicklung. Der Ansatz erhöht die Zuversicht in das Portfolio, indem er robuste und reproduzierbare Hautmodelle für die frühe Entdeckung und präklinische Bewertung ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen innerhalb eines menschlichen Hautmikromilieus.
- Ermöglicht die mechanistische Ent风险bewertung durch Modellierung der Anhangsentwicklung und Gewebeschichtung.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung für hautrelevante Signalwege und seltene Krankheitsmechanismen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet eine standardisierte, reproduzierbare Plattform zur quantitativen Beurteilung von Arzneimittelwirkungen und Gewebeschäden.
- Liefert validierte biologische Systeme mit Haarfollikeln und Talgdrüsen für die Wirkstoffbewertung.
- Ermöglicht die Skalierbarkeit von Assays und die Wiederverwendung der Plattform für vielfältige Anwendungen in der Hautforschung.
Translationale und präklinische Forschung
- Modelliert für die Krankheit relevante Gewebeantworten, einschließlich UVB-induzierter Schäden und pathogener Infektionen.
- Ermöglicht die Anpassung an translational orientierte Biomarker-Strategien durch molekulare und histologische Analysen.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung, indem Entdeckung und präklinische Validierung miteinander verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Organoid-System integriert die frühe Forschung bis hin zur präklinischen Untersuchung und ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen, die Aufklärung von Signalwegen sowie prädiktive Analysen für die Hautbiologie.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt hypothesengetriebene Studien zur Hautarchitektur und Anhangsbildung.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für Wirkstoff- und Schadensreaktions-Assays.
- Analytik: Ermöglicht molekulare und histologische Auswertungen für den Vergleich verschiedener Bedingungen.
- Translationale Forschung: Erleichtert den nahtlosen Übergang von in-vitro-Modellen zu präklinischen Krankheitsstudien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für zahlreiche Forschungs- und Screening-Projekte zur Haut.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der Hautforschung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Workflows zur Organoid-Generierung.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalnutzungseffizienz durch robuste in-vitro-Modellierung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung dermatologischer Assets.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von Stammzellen, der Manipulation von Organoiden und der Gewebeengineering.
- Setzt den Zugang zu spezialisierten Geräten für die Kultur an der Luft-Flüssig-Grenzfläche und für molekulare Analysen voraus.
- Erfordert eine standardisierte, interdisziplinäre Abstimmung qualitativer Bewertungsschwellen und Selektionskriterien.
- Kann je nach Forschungsschwerpunkt eine Anpassung an verschiedene Krankheitsmodelle oder Gewebetypen erfordern.
- Praktische Einschränkungen sind lange Kulturdauern und die andauernde Charakterisierung im Fachgebiet.
