In vitro Resident Memory CD8 T-Zell-Differenzierung mit dem epithelialen Organoid-T-Zell-Kokultursystem

Unsere Forschung untersucht CD8-residente Gedächtnis-T-Zellen im weiblichen Fortpflanzungstrakt und untersucht, wie Infektionen und Krankheiten ihre Residenz, Funktion, Erhaltung und therapeutisches Potenzial beeinflussen. Bestehende Methoden begrenzen das Überleben und die phänotypische Stabilität der residenten Gedächtnis-T-Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht skalierbare In-vitro-Studien, indem Geweberesidenz mittels organoider T-Zell-Kultkultur induziert wird.

Zunächst werden vaginale Epithelorganoide oder VEOs mit einer Dichte von 10.000 Zellen in 20 Mikrolitern Basalmembran pro Bohrloch einer 24-Well-Platte extrahiert. Stellen Sie die Platte in den Inkubator und bewahren Sie die Kulturen sieben bis zehn Tage lang bei 37 Grad Celsius auf. An einem Tag vor der Kokultur wird das Zellkulturmedium aus den vorgesehenen Brunnen aspiriert und mit DPBS gewaschen.

Aspiratiere das DPBS und gib dann 600 Mikroliter vorgewärmtes 0,25%-Trypsin EDTA in den Brunnen ab. Mit einer BSA-beschichteten P1000-Pipette wird gründlich wieder suspendiert, um den Basalmembranextrakt mechanisch zu stören und den Inhalt des Brunnens in ein BSA-beschichtetes, steriles 15-Milliliter-konisches Rohr zu übertragen. Jetzt setze das konische Rohr in ein 37-Grad-Wasserbad.

Nach fünf Minuten gib 10 Milliliter 10 % FBS RPMI hinzu, um die Trypsinisierung zu dämpfen. Dann setzen Sie das Rohr in die Zentrifuge und drehen Sie fünf Minuten lang bei 500 G bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie das Supernatant. Mit einer BSA-beschichteten Pipettenspitze wird das Pellet in 100 bis 300 Mikrolitern T-Zell-Organoidkulturmedium oder einfachem DMEMF-12 neu suspendiert.

Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie das Virusvolumen, das erforderlich ist, um eine Infektionsmultiplikation von 0,1 zu erreichen, anhand der Gesamtzellzahl und des bekannten viralen Titers. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus den für die Infektion ausgewählten VEO-Brunnen.

Waschen Sie jeden Brunnen mit 500 Mikrolitern vorgewärmtem DPBS und setzen Sie die Platte für fünf Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach fünf Minuten werfen Sie das DPBS ab. Fügen Sie 500 Mikroliter organoides Medium hinzu, das genügend virale Partikel enthält, um eine Infektionsmultiplikation von 0,1 zu erreichen.

Stellen Sie den Teller für eine Stunde in einen 37 Grad Celsius Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und bewegen Sie den Teller alle 20 bis 30 Minuten vorsichtig von Hand. Übertragen Sie die entsprechende Menge an Basalmembranextrakt, die für das Plattieren benötigt wird, von minus 80 Grad Celsius auf vier Grad Celsius und lassen Sie es acht Stunden auftauen. Untersuchen Sie die VEOs unter einem Lichtmikroskop, um Größe und allgemeine Gesundheit zu beurteilen.

Bestätigen Sie, dass die VEOs etwa 100 Mikrometer im Durchmesser haben, mit einer einheitlichen runden Morphologie und minimalen Einzelzellen. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus den VEE-Brunnen und waschen Sie jedes Bohrloch mit 500 Mikrolitern kaltsteriler DPBS, die bei zwei bis acht Grad Celsius gehalten werden. Nach dem Entfernen des DPBS werden 200 bis 500 Mikroliter kalte organoide Entnahmelösung zu jedem Bohrloch hinzugefügt, wobei mindestens ein 10-faches Volumen im Vergleich zum Basalmembranextrakt-Tröpfchen gewährleistet ist.

Anschließend wird mit einer BSA-beschichteten P200-Pipette mechanisch der Basalmembranextrakt zerstört. Nun lege die Platte auf einen Orbitalshaker, der auf etwa 100 Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius für 20 Minuten eingestellt ist. Nach der Inkubation verwenden Sie eine BSA-beschichtete Pipettenspitze, um den Inhalt jedes Brunnens zu mischen und in ein BSA-beschichtetes, steriles 15-Milliliter-konisches Rohr zu übertragen.

Setzen Sie das Rohr in die Zentrifuge und drehen Sie es fünf Minuten lang bei 500 G bei vier Grad Celsius. Dann entsorge das Supernatant. Waschen Sie das VEE-Pellet mit fünf bis zehn Millilitern kaltem DPBS und zentrifugieren Sie es erneut bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Aspirieren Sie das DPBS, dann mit einer P1000-Pipettenspitze, suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter T-Zell-Organoidkulturmedium und legen Sie die VEE-Suspension auf Eis, bis die T-Zellen bereit für die Kokultur sind. Um T-Zellen zu sammeln, untersuchen Sie die Ruhe-T-Zellen unter einem Lichtmikroskop, um Größe und allgemeine Gesundheit zu beurteilen. Bestätigen Sie, dass die T-Zellen eine gewisse Clusterbildung, eine vergrößerte Morphologie und keine sichtbaren Zellreste oder -fragmente aufweisen.

Mit einer P1000-Pipette werden die T-Zellen durch mehrfaches Pipettern in jeder Ecke des Bohrlochs wieder aufgehängt und gepflegt. Sammeln Sie ein konisches Rohr und zählen Sie die Gesamtzahl der lebenden CD8-T-Zellen. Anschließend wird die T-Zell-Suspension in die Zentrifuge gegeben und fünf Minuten lang mit 584 G bei vier Grad Celsius gedreht.

Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das T-Zell-Pellet in 10 Millilitern T-Zell-Organoidkulturmedium. Dann wird die entsprechende Anzahl von T-Zellen in das konische Rohr mit den zuvor vorbereiteten VEOs übertragen, um die Zellen zu verbinden. Setzen Sie die kombinierte VEO- und T-Zell-Suspension in die Zentrifuge und drehen Sie erneut bei 584 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach dem Entsorgen des Supernatants werden die VEOs und T-Zellen im entsprechenden Volumen des Basalmembranextrakts wieder suspendiert. Dann wird mit einer weiteren Pipettspitze die Suspension auf die vorgewärmte Gewebekulturplatte aufgetragen und pro Muld 20 Mikroliter für eine 24-Well-Platte gegeben. Jetzt werden die Gewebekulturplatte umgekehrt und kopfüber in einen 37-Grad-Inkubator gelegt.

Nehmen Sie 30 Minuten für die vollständige Haftung und Verhärtung der Basalmembranextrakte. Nach der Inkubationszeit werden vorsichtig das ergänzte vollständige T-Zell-Organoidkulturmedium zu jedem Brunnen hinzugefügt. Geben Sie 500 Mikroliter pro Bohrloch für eine 24-Bohrloch-Platte oder 250 Mikroliter pro Bohrloch für eine 96-Bohrloch-Platte ab und geben Sie das Medium an die Seite des Lochs, um die Störung des Extrakttröpfchens der Kellermembran zu vermeiden.

Ersetzen Sie das Kulturmedium alle zwei Tage, bis die Proben für die Durchflusszytometrie entnommen wurden. Siebentägige Maus-VEOs, infizierte mit dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus, das gelbes fluoreszierendes Protein exprimiert, zeigten bereits vier Stunden nach der Kokultur reichlich virale Replikation, sichtbar als fluoreszierende Signale innerhalb der Organoide. Die Ansammlung von CD8-T-Zellen in der Nähe infizierter Organoide wurde zu späteren Zeitpunkten während der Kokultur deutlich sichtbar.

Die fortschreitende Aggregation von CD8-T-Zellen war mit einer sichtbaren Reduktion des gelben fluoreszierenden Proteinsignals in infizierten Organoiden zu späteren Zeitpunkten assoziiert. CD8-T-Zellen, die mit infizierten VEOs kokultiviert wurden, zeigten im Laufe der Zeit eine erhöhte Expression von CD 69 und CD 103, was auf den Erwerb eines geweberesidenten Gedächtnis hindeutet. Antigen-stimulierte CD69-positive, CD103-positive CD8-T-Zellen zeigten im Vergleich zu unstimulierten Kontrollgruppen eine signifikante Steigerung der intrazellulären Produktion von Interferon-Gamma und Interleukin-2.

Dieses Protokoll ermöglicht die in-vitro-Untersuchung von CD8-residenten Speicher-T-Zellen und ermöglicht so eine effiziente Manipulation von Epithel- und T-Zellen ohne Abhängigkeit von Tiermodellen. Die wichtigste Herausforderung in diesem Protokoll ist die Erhaltung gesunder, lebensfähiger T-Zellen und vaginaler epithelialer Organoide, da schlechte Lebensfähigkeit oder Infektion das Überleben der Kokultur und die experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen. Wir konzentrierten uns auf die Durchflusszytometrie, aber Kokulturen können für Färbung, Bildgebung und Sequenzierung gesammelt werden.

Das sichere Medium ermöglicht nachgelagerte ELISA.