Räumliche molekulare Bildgebung des Glycomes mittels Massenspektrometrie

Wir nutzen spannende, neue massenspektrometriebasierte Technologien, um Biomoleküle in biologischen Proben für die räumliche Biologie zu kartieren. Wichtige aktuelle Herausforderungen sind Strenge und Reproduzierbarkeit durch die Probenvorbereitung sowie Einschränkungen bei Empfindlichkeit und Auflösung. Zu Beginn bereiten Sie einen oder mehrere Dialysebecher vor, indem Sie sie für 15 Minuten in Hochleistungs-Flüssigchromatographie oder HPLC-Wasser stellen.

Dialyse 200 Mikroliter Standardisoamylase mit einem 500-Mikroliter-Dialysebecher in 14,3 Millilitern HPLC-Wasser für zwei Stunden bei vier Grad Celsius ohne Rühren. Mit einer Pipette entferne die Isoamylase vorsichtig aus dem Dialysebecher und lege sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Missen Sie das Gesamtvolumen der Isoamylase-Lösung nach der Dialyse.

Basierend auf der Lageraktivität von 200 Einheiten pro Milliliter und dem Endvolumen wird das Gesamtvolumen berechnet, das für drei Einheiten Isoamylase benötigt wird. Pipettenaliquoten, die drei Einheiten Isoamylase enthalten, in dünnwandige PCR-Röhren. Kühlen Sie die Röhren mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.

Wenn das Gewebe verarbeitet und fertig ist, bereiten Sie die Feuchtigkeitskammer vor, indem Sie ein mit deionisiertem Wasser getränktes Papiertuch unter das Metallgestell legen. Stellen Sie die Kammer in einen 37-Grad-Inkubator zur Gleichgewichtung. Dann füllen Sie den Behälter mit Leitungswasser bis zur Oberfläche und stellen Sie den Timer auf 60 Minuten, um das Gerät einzuschalten.

Platzieren Sie den Objektträger so, dass das Gewebe nach innen zeigt, um den Kontakt mit den Seiten zu vermeiden und eine effektive Antigenentnahme sicherzustellen. Füllen Sie jeden Dia-Mailer mit dem frisch zubereiteten Citraconic-Puffer. Überprüfen Sie, ob Dampf vom Lebensmitteldampfer abtritt.

Platzieren Sie die Mailer in den Dampfer und befruchten Sie sie 30 Minuten lang. Dann werden die Pakete für fünf Minuten in ein deionisiertes Wasserbad gesteckt. Ersetzen Sie die Hälfte des citrakonischen Puffers in jedem Umschlag durch deionisiertes Wasser und lassen Sie es weitere fünf Minuten stehen.

Entfernen Sie alle Lösungsmittel und waschen Sie die Objektträger, indem Sie 100 % deionisiertes Wasser zu jedem Formular hinzufügen und dann entfernen. Auf der Rückseite jeder Folie zeichnen Sie einen Kreis und ein Dreieck, um die internen Standardpositionen zu markieren. Tragen Sie einen Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Meerrettichperoxidase an der Kreismarke auf und einen Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter Kaninchenleberglykogen an der Dreiecksmarke.

Tauen Sie ein Rohr mit 100 Mikrogramm lyophilisiertem Peptid N Glycosidase F und ein Röhrchen mit drei Einheiten Isoamylase für 10 Minuten auf. Zentrifugieren Sie die Röhren bei etwa 2000 G für fünf Sekunden. Pipettieren Sie 50 Mikroliter deionisiertes Wasser in jedes gevrieste PNGase-F-Rohr.

Nach dem sanften Vortex zentrifugieren Sie das Rohr bei etwa 2000 G für fünf Sekunden. Pipettieren Sie die resultierenden 50 Mikroliter PNGase-F-Lösung direkt in das Isoamylase-Rohr und fügen Sie HPLC-Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf einen Milliliter zu bringen. Schalte den HTX M5-Sprüher ein und öffne die HTX M5-Software auf dem angeschlossenen Computer.

Schalten Sie die Knauer-Pumpe aus, indem Sie den Stoppknopf auf der vorderen rechten Seite drücken, und schalten Sie die externe Spritzenpumpe über den Schalter auf der Rückseite ein. In der HTX-Software wählen Sie unter dem Reiter Methoden die passende Methode für das Dual-Enzym-Sprühen aus. Gehen Sie zum Reiter Temperatur und stellen Sie die Sprühdüsetemperatur auf 45 Grad Celsius ein.

Öffnen Sie das ultrareine Stickstoffgasventil und stellen Sie sicher, dass der Sprühdruck auf 10 Pfund pro Quadratzoll eingestellt ist. Mit einer frischen Spritze und Nadel füllen Sie es mit vier Millilitern HPLC-Qualitätswasser. Nachdem Sie die Blasen entfernt haben, führen Sie zwei Milliliter Wasser durch einen etwa sechs Zoll langen Abschnitt der Sprühleitung in einen Abfallbecher.

Befestigen Sie die Spritze an der Sprühleitung und leiten Sie das Wasser durch die Spritzpumpe, indem Sie das System mit einer Durchflussrate von 95 Mikrolitern pro Minute für fünf Minuten starten. Während die Spritzpumpe spült, kleben Sie die vorbereiteten Schlitten mit einer Metallausrichtungsführung an die untere linke Ecke des beheizten Tabletts. Definiere unter dem Reiter Sample die X- und Y-Parameter für die Sprühregion.

Nach fünf Minuten die Spritzenpumpe anhalten und die Spritze abkoppeln. Sauge Luft hinein und drücke die Luft durch die Sprühleitung, um restliches Wasser zu entfernen. Dann wird die vorbereitete Dual-Enzym-Lösung in eine neue Spritze geladen und sicher an die Spritzpumpe angeschlossen.

Schließen Sie die geladene Spritze mit der dualen Enzymlösung an die Sprühleitung an. Sobald die Temperatur der Sprühdüse 45 Grad Celsius erreicht, drücken Sie unter dem Zyklus-Tab auf Start. Wenn Sie aufgefordert werden, die Knauer-Pumpe einzuschalten, klicken Sie auf Nr. Drücken Sie Start an der Spritzpumpe, um mit dem Enzymsprühen zu beginnen.

Setzen Sie einen Leerschlitten unter die Sprühdüse, um die sichtbare Enzymablagerung zu bestätigen. Sobald das Enzymspray sichtbar gleichmäßig ist, klicken Sie in der Software auf Weiterfahren. Als Nächstes legen Sie die Glasabdeckung auf die Sprühmaschine und achten Sie auf eine gleichmäßige Applikation, um eine gleichmäßige Befeuchtung über die Oberfläche des Objektträgers zu gewährleisten.

Wenn der Sprühzyklus abgeschlossen ist, drücken Sie Stopp an der Spritzenpumpe. Schalte das Stickstoffgasventil ab und klicke in der Software auf Ventillast Bestätigen. Inkubieren Sie die besprühten Objektträger zwei Stunden lang in der HTX-Luftfeuchtigkeitskammer bei 37 Grad Celsius und stellen Sie sicher, dass die Objektträger nach oben gerichtet sind.

Nach Abschluss der Inkubation werden die Objektträger in einen Austrocknungsbehälter umgefüllt und 15 Minuten lang getrocknet. Glykogen-abgeleitete Oligosaccharide und N-gebundene Glykane wurden über einen weiten Masterladungsbereich in der Leber mittels matrixunterstützter Laser-Desorptions-Ionisationsmassespektrometrie-Bildgebung nachgewiesen. Glykogen war breit verteilt in den Leber-Hepatozyten, während es in den Gefäßen und Bindegewebe in den Portalbahnen fehlte.

Die räumliche Verteilung des Glykogens und seine Kettenlängenverteilung waren beide mit MALDI MSI messbar. Eine N-gebundene Glykanart war weit verbreitet in Leberhepatozyten. Eine weitere N-gebundene Glykan-Art zeigte ein regionaleres Verbreitungsmuster, das mit der sinusförmigen Struktur der Leber übereinstimmt.

Ein eigenständiger und verbundener Glykan, der speziell auf Elemente des Portaltrakts beschränkt ist. Die histologische Färbung bestätigte die anatomischen Strukturen des Portaltrakts, einschließlich der Ptalvene, des Gallengangs und des Bindegewebes. Wir nutzen räumliche molekulare Bildgebung, um die zellulären, metabolischen und molekularen Grundlagen der Zellbiologie, Physiologie und Krankheitspathologie aufzudecken.

Diese Ergebnisse ermöglichen eine molekulare Bildgebung des Glycomes in verschiedenen biologischen Quellen und Krankheitszuständen. Zukünftige Forschungen werden den Nachweis verschiedener Glykomklassen ermöglichen und die Empfindlichkeit sowie Auflösung auf Einzelzellniveau erhöhen.