Verkalkte Arterienvorbereitung und -verarbeitung mit erhaltener Morphologie und RNA für digitale räumliche Profilierung

Die räumliche Transkriptomik bietet einen Vorteil gegenüber sowohl Einzelzell-RNA-Seq als auch Bulk-RNA-Seq, da räumliche Informationen im Gewebe erhalten bleiben. Durch den Einsatz von Tools wie RNAscope, computergestützter Dekonvolution und öffentlich verfügbaren Einzelzelldatensätzen ist es möglich, das zelluläre Verhalten auf ihre Nische und Genprofile abzubilden und eine integrierte Sicht auf die Gewebebiologie zu erstellen. Diese Technologie explodiert.

Zwei Nature-Artikel vom Mai 2025 konzentrieren sich auf Studien zur räumlichen Transkriptomik. Wenn wir PubMed betrachten, ist die Kurve noch steiler: etwa 150 räumliche Artikel im Jahr 2023, fast 300 im Jahr 2024 und auf dem besten Weg, bis 2025 mehr als 500 Publikationen zu erreichen. Die räumliche Transkriptomik hat bereits mehrere wichtige Forschungsbereiche umgestaltet, wie Krebsbiologie, Neurowissenschaften, Immunologie und Entwicklungsbiologie.

Doch die Gefäßbiologie hinkt hinterher. Die Heterogenität und einzigartige Geometrie von Arterien und Venen machen sie für die Gewebebindung und RNA-Erhaltung schwierig. Darüber hinaus weisen fortgeschrittene Gefäßläsionen Verkalkung und Thrombose auf, was die Gewebeintegrität weiter verringert.

Dieses Protokoll ist speziell für schiffsähnliche Strukturen konzipiert. Wir enthalten außerdem Methoden zur Senkung der Kosten und die notwendigen Färbungsverfahren zur Bewertung von RNA, Kalziumablagerung und interessierenden Zellen. Angesichts der derzeitigen Knappheit an vaskulär-fokussierten räumlichen Transkriptomikstudien im Vergleich zu anderen Fachgebieten ist dieses Protokoll kosteneffizient und anfängerfreundlich konzipiert und bietet Gefäßforschern zugängliche Werkzeuge, um räumliche Transkriptomik in ihre Studien einzusetzen.

Dieses Protokoll ist auch potenziell hilfreich für große Kohortenstichproben für klinische Experimente. In diesem Protokoll beschreiben wir detaillierte Verfahren, die den sorgfältigen Umgang mit verkalkten Arteriengeweben, Eigenschaftskalkifikationsmethoden zur Erhaltung der RNA-Qualität und Gewebemorphologie, Färbungstechniken zur Verifikation und Anleitung bei der ROI-Auswahl sowie die abschließende morphologische Markerfärbung auf präparierten Objektträgern umfassen, um sicherzustellen, dass sie für die Verarbeitung auf dem digitalen Spatial Profiler bereit sind. Menschliche Tibiaarterien, einschließlich der vorderen Tibiaarterien, hinteren Tibialarterien und Perinealarterien, wurden aus Amputationsproben des Patienten entnommen und in DMEM gespeichert, das 1 % HEPES und 1 % Pen-Strep enthält.

Jede Arterie wird zusammen mit dem Medium auf eine 100-Millimeter-Petrischale übertragen. Überschüssiges perivaskuläres Bindegewebe wird mit steriler Schere und Pinzette entfernt, sodass nur noch die Arterienwand übrig bleibt. Die abgeschnittene Arterie wird auf eine neue Petrischale übertragen.

Im Inneren des Gerichts wird ein steriles Schneidebrett vorbereitet. Die Arterien werden mit einer chirurgischen Klinge in ein Zentimeter große Abschnitte geschnitten. Zwei Segmente jeder Arterie werden in Kryoröhren in flüssigem Stickstoff zum Kryokonservieren und zur Speicherung für zukünftige Protein- oder RNA-Arbeiten gefroren.

Die übrigen Segmente werden in 15-Milliliter-Röhren mit 10 % neutralem gepuffertem Formalin platziert und für 24 bis 48 Stunden auf vier Grad Celsius fixiert. Die Entkalkungslösung mit 10 % EDTA in einer RNA-Stabilisierungslösung wird vorbereitet, wobei der pH-Wert für die Arbeitslösung auf 5,2 angepasst wird. Die fixierten Gewebe werden in eine neue Schüssel mit PBS übertragen und kurz gewaschen.

Jede Probe wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit Entkalkungslösung umgefüllt und 72 Stunden lang bei vier Grad Celsius bewegt. Nach Abschluss der Entkalkung werden die Proben zweimal mit PBS und sanftem Rühren für fünf Minuten gewaschen. Taschentücher werden in Kassetten übertragen.

Die Kassetten werden in einen Gewebeprozessor gelegt. Die Formalinverarbeitung dauert mindestens vier Stunden. Die Zeit kann je nach Stichprobenmatrix variiert werden.

Mehrere Arteriensegmente werden pro Block platziert. Der Block wird mit Paraffin gefüllt und vollständig abkühlen lassen. Die Objektträger werden vorbereitet, indem der eingeschränkte Gewebebereich auf den Rückseiten des Objektträgers markiert wird.

Bestätigen Sie, dass alle Segmente im vom GeoMx DSP-Instrument geforderten begrenzten Bereich liegen. Überschüssiges Paraffin wird von den Blöcken entfernt. Die Blöcke werden dann auf fünf Mikrometer mit flachprofiligen Klingen geschnitten.

Die Gewebebänder sind innerhalb des markierten Bereichs angebracht. Im DSP-Experiment werden mindestens vier serielle Schnitte pro Block für verschiedene Färbungen montiert. Lagern Sie die Objektträger bis zum Gebrauch bei vier Grad Celsius auf.

Anschließend werden RNAscope-In-situ-Hybridisierungen sowie histologische Färbungen an seriell präparierten Objektträgern durchgeführt. Zusätzlich wird ein weiterer Satz von Objektträgern mit morphologischen Markern gefärbt, wie CD45 für Immunzellen und Alpha-SMA für glatte Muskelzellen. Das RNAscope-In-situ-Hybridisierungsverfahren besteht kurz aus vier Hauptschritten: Slide-Backen als Vorbehandlung, Standard-Deparaffinisierung und Rehydration, Zielabruf, Probe-Hybridisierung mit Signalverstärkung und Farbstofffärbung zur RNA-Visualisierung.

Zur histologischen Validierung werden sowohl die H&E-Färbung als auch die Alizarin-Rot-S-Färbung durchgeführt, um eine präzise Lokalisierung der Kalziumablagerungen zu ermöglichen. Abschließend wird die morphologische Markerfärbung mit einem standardisierten immunhistochemischen Protokoll durchgeführt, um die interessierenden Zellen zu identifizieren und die ROI-Auswahl zu steuern. In dieser Studie wurden zwei EDTA-basierte Protokolle verglichen: eins, 10 % EDTA allein für 72 Stunden, und zwei, 10 % EDTA- und RNA-stabilisierende Lösung für die gleiche Dauer.

Morphologie und RNA-Qualität wurden durch RNAscope-In-situ-Hybridisierung bewertet. Beide Methoden bewahrten die Gefäßarchitektur, aber Objektträger, die mit dem EDTA- und RNA-Stabilisierungslösungscocktail behandelt wurden, zeigten deutlich stärkere RNA-Signale, wie im rechten Panel gezeigt, was darauf hindeutet, dass RNA-stabilisierende Lösung Transkripte schützt, während EDTA kristallines Calciumphosphat chelatiert und die Probe allmählich weicher macht, ohne RNasen zu aktivieren. Mit optimierter RNA-Erhaltungsstrategie und Qualitätsbestätigung demonstrieren wir die Schritte der histologischen Färbung für Kalziumablagerungen mit Hämatoxylin und Eosin sowie Alizarin Red S. Alizarin bindet selektiv ionische Kalziumsalze und wechselt im Farbton von orange zu ziegelrot, wodurch Mikro- und Makroverkalkungen empfindlich hervorgehoben werden, obwohl es weniger zelluläre und extrazelluläre Matrixdetails liefert als H&E.

Die Verwendung beider Beizen maximiert strukturelle und kompositorische Informationen. Nach morphologischer Markerfärbung werden die Objektträger auf der GeoMx-Plattform gescannt. Antikörper CD45 markiert Immunzellen, während Alpha-glattes Muskel-Aktin die in den Medien reichlich vorhandenen glatten Gefäßzellen markiert.

Die ausgewählten ROIs umfassen etwa 100 bis 150 Kerne mit ausreichender RNA-Ausbeute. Die ROIs wurden neben und weit entfernt von verkalkten Bereichen platziert, um räumliche Genexpressionsmuster zu vergleichen, die für die mediale Verkalkung der Tibiaarterie relevant sind. Trotz einiger Gewebeverluste während der mehrstündigen Verarbeitungsschritte wurden in jedem Arterieabschnitt mehrere geeignete ROIs identifiziert.

Abschließend umfasst dieser Workflow die Handhabung und Entkalkung von verkalktem Arteriengewebe durch Validierungsfärbung und ROI-Auswahl für eine räumliche Transkriptomikstudie. Insbesondere sorgt die Kombination von H&E mit calciumspezifischer Alizarin-Färbung für eine präzise Lokalisierung der vaskulären Verkalkung und maximiert sowohl strukturelle als auch kompositionelle Informationen für die ROI-Platzierung. Die RNAscope-Analyse zeigt, dass entkalkte arterielle Schnitte weitgehend intakt bleiben und genügend RNA vorhanden sind.