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Methodenartikel
In diesem Artikel wird ein umfassendes Protokoll zur Untersuchung des Cardiotrophin-ähnlichen Zytokinfaktors 1 (CLCF1) als belastungsinduzierter Mediator des Knochenschutzes durch RANKL/OPG-Achsenmodulation bei postmenopausaler Osteoporose vorgestellt.
Jüngste Studien haben den Cardiotrophin-ähnlichen Zytokinfaktor 1 (CLCF1) als ein trainingsinduziertes "Jugendmolekül" identifiziert, das die Vorteile des Bewegungsapparates vermittelt, aber mit zunehmendem Alter abnimmt. Dieses Protokoll beschreibt einen systematischen Ansatz, um die regulatorische Rolle von CLCF1 beim trainingsvermittelten Knochenschutz über Immun-Knochen-Crosstalk-Mechanismen zu untersuchen. Die Methodik umfasst klinische Probenanalysen, molekulare Charakterisierungstechniken und funktionelle Assays, um den Einfluss von CLCF1 auf den Rezeptoraktivator der Signalachse des Kernfaktor-κB-Liganden (RANKL)/Osteoprotegerin (OPG) aufzuklären. Durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Western Blotting, CRISPR/Cas9-Geneditierung und Co-Kultursysteme demonstriert dieses Protokoll die duale knochenschützende Wirkung von CLCF1 über die STAT1-vermittelte Osteoklastenhemmung und die STAT3-vermittelte Osteoblastenförderung. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die umfassende Bewertung von CLCF1-Expressionsmustern, Korrelationsanalysen mit Knochenmineraldichteparametern und die mechanistische Bewertung potenzieller trainingsmimetischer Behandlungsinterventionen. Im Gegensatz zu herkömmlichen antiresorptiven Therapien, die in erster Linie auf Osteoklasten abzielen, können CLCF1-basierte Interventionen den einzigartigen Vorteil bieten, dass sie gleichzeitig die Knochenbildung fördern und gleichzeitig die Resorption hemmen. Dieses Protokoll bietet Forschern standardisierte Verfahren zur Untersuchung der trainingsinduzierten Zytokin-vermittelten Regulation des Knochenstoffwechsels und erleichtert die Entwicklung gezielter therapeutischer Interventionen für altersbedingte Knochenerkrankungen.
Die postmenopausale Osteoporose (PMOP) stellt ein paradigmatisches Beispiel für den altersbedingten Muskel-Skelett-Verfall dar, bei dem eine Dysregulation des Immunsystems zu einem pathologischen Knochenverlust führt 1,2,3. Obwohl Bewegung weithin als die wirksamste nicht-pharmakologische Intervention zur Verhinderung des altersbedingten Knochenabbaus anerkannt ist, blieben die genauen molekularen Mechanismen, die dem trainingsinduzierten Knochenschutz zugrunde liegen, bis vor kurzem schwer fassbar4. Das zeitgenössisch....
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Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission der institutionellen Forschung (Protokoll #2024-CHSD-0156) genehmigt und entspricht den Prinzipien der Deklaration von Helsinki. Alle Tierverfahren entsprachen den Richtlinien des institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung (Protokoll #2024-037). Alle Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.
1. Klinische Probenentnahme und Bewertung der Bewegungsintervention
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Die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls demonstriert die regulatorische Rolle von CLCF1 im immunvermittelten Knochenstoffwechsel unter Verwendung mehrerer experimenteller Ansätze. Die klinischen Validierungsstudien zeigen eine signifikante Herunterregulierung der CLCF1-Expression bei PMOP-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen, wie in Abbildung 1A gezeigt. Die quantitative PCR-Analyse von mononukleären Zelle.......
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Das hierin beschriebene Protokoll bietet einen umfassenden methodischen Rahmen für die Untersuchung der Rolle von CLCF1 als trainingsinduzierter Mediator des Knochenschutzes durch eine systematische Analyse der RANKL/OPG-Achse. Jüngste bahnbrechende Forschungen haben CLCF1 als einen trainingsinduzierten Faktor identifiziert, der den altersbedingten Muskel-Skelett-Abbau bekämpft, und ihn als zentralen Mediator des trainingsinduzierten Knochenschutzes positioniert 34,35,36.
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Die Autoren danken den Teilnehmern, die sich freiwillig für diese Studie gemeldet haben, und dem klinischen Personal des Zentralkrankenhauses, das der Shandong First Medical University angegliedert ist, für ihre Unterstützung bei der Patientenrekrutierung und Probenentnahme. Wir danken den Labortechnikern für ihre Unterstützung bei Zellkultur- und molekularbiologischen Experimenten. H.Z. konzipierte und konzipierte die Studie, führte die Experimente durch, analysierte die Daten und schrieb das Manuskript. H.L. trug zum Versuchsdesign, zur Datenerfassung und zur Überarbeitung des Manuskripts bei. Y.S. betreute das Projekt, gab kritisch....
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Cell Culture Media & Reagenzien | |||
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Purpose_Application: Kryokonservierungsmedium-Komponente Specifications_Comments: Molekularbiologische Qualität, steril gefiltert |
| DMEM-Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Purpose_Application: MG-63 Osteoblastenkulturmedium Specifications_Comments: Hochglukose-Formulierung mit L-Glutamin |
| Fetales Rinderserum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Purpose_Application: Zellkulturpräparat (hitzeinaktiviert) Specifications_Comments: Wärmeinaktiviert bei 56 Â ° C für 30 Minuten |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Purpose_Application: Antibiotikapräparat für sterile Kultur Specifications_Comments: 100-fache Aktie, Endkonzentration 1 % |
| Polybren (Hexadimethrinbromid) | Santa Cruz Biotechnologie | SC-134220 | Purpose_Application: Lentivirale Transduktions-Enhancer Specifications_Comments: 8 Î ¼ g/mL Arbeitskonzentration |
| Puromycin-Dihydrochlorid | InvivoGen | ANT-PR-1 | Purpose_Application: Selektionsantibiotikum für transduzierte Zellen Specifications_Comments: 4 Î ¼ g/mL-Selektionskonzentration für 7 Tage |
| RPMI-1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Purpose_Application: Raji B-Lymphozytenkulturmedium Specifications_Comments: Mit L-Glutamin, ohne rotes Phenol bevorzugt |
| Trypan-Blau-Lösung | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Purpose_Application: Zellviabilitätsbewertung Specifications_Comments: 0,4%-Lösung für den Ausschlusstest |
| Gefrierbehälter mit kontrollierter Rate | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Purpose_Application: Kontrolliertes Zellgefrieren (-1Â ° C/min) Specifications_Comments: Mr. Frosty oder äquivalent für -1 & Acirc; ° C/min-Kühlung |
| EDTA-Blutabnahmeröhrchen | BD Biosciences | 366643 | Purpose_Application: Venöse Blutentnahme mit Antikoagulans Specifications_Comments: 10–20 ml Kapazität, violette obere Röhren |
| Ficoll-Paque PLUS Dichtegradient | Cytiva (GE Healthcare) | 17144003 | Purpose_Application: PBMC-Isolierung mittels Dichtezentrifugation Specifications_Comments: Steril, endotoxingetestet auf Zelltrennung. |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | Purpose_Application: Zellreinigung und Verdünnungspuffer Specifications_Comments: Steril, zellkulturfähig |
| RNA-Extraktion & qPCR | |||
| Chloroform (ACS-Qualität) | Sigma-Aldrich | C2432 | Purpose_Application: Phasentrennung bei RNA-Extraktion Specifications_Comments: ACS-Reagenzqualität â ‰ & Yen; 99 % Reinheit |
| Ethanol (75 %, Molekularqualität) | Sigma-Aldrich | E7023 | Purpose_Application: RNA-Pelletwäsche Specifications_Comments: Molekularbiologie-Qualität, frisch vorbereitet |
| Isopropanol (Molekularqualität) | Sigma-Aldrich | I9516 | Purpose_Application: RNA-Präzipitation Specifications_Comments: Molekularbiologie-Qualität, â ‰ & Yen; 99,5 % Reinheit |
| Nukleasefreies Wasser | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | Purpose_Application: PCR-Reaktionsvorbereitung Specifications_Comments: Frei von DNase/RNase, getestet für PCR-Anwendungen |
| Optischer Klebefilm | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Purpose_Application: Optische Abdichtung für qPCR-Platten Specifications_Comments: Optische Qualität für qPCR-Anwendungen |
| PCR-Platten (96-Well) | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | Purpose_Application: 96-Well-Format für Hochdurchsatz qPCR Specifications_Comments: Weiß, klarer Boden für optische Detektion |
| PCR-Röhrenstreifen | Thermo Fisher Scientific | AB0451 | Purpose_Application: PCR-Reaktionen mit kleinem Volumen Specifications_Comments: 8-Röhrenstreifen mit einzelnen Kappen |
| PrimeScript RT Reagenz-Kit | Takara-Biografie | RR037A | Purpose_Application: Reverse-Transkription von RNA zu cDNA Specifications_Comments: Mit gDNA-Eraser zur genomischen DNA-Entfernung |
| SYBR Green Master Mix | Angewandte Biosysteme | 4309155 | Purpose_Application: Echtzeit-PCR-Verstärkung und -Erkennung Specifications_Comments: Mit ROX-Referenzfarbe zur Normalisierung |
| TRIzol-Reagenz (RNA-Lyse) | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Purpose_Application: Zelllyse und RNA-Extraktion Specifications_Comments: Lagern bei 4Â ° C, innerhalb von 6 Monaten verwenden |
| Proteinanalyse – Western Blot | |||
| Acrylamid/Bis-Acrylamid (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | Purpose_Application: SDS-PAGE Gel-Polymerisation Specifications_Comments: 30% Acrylamid-Stocklösung |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | Purpose_Application: Quantifizierung der Proteinkonzentration Specifications_Comments: Reduzierungskompatibel für eine genaue Quantifizierung |
| Verbessertes Chemilumineszenz-(ECL)-Substrat | Thermo Fisher Scientific | 32106 | Purpose_Application: Chemilumineszente Proteindetektion Specifications_Comments: Femtogramm-Sensitivitätsdetektion |
| Fettfreie Trockenmilch | Laborwissenschaft | 170-6404 | Purpose_Application: Westlicher Blot-Blockiermittel Specifications_Comments: Blockwert, niedriger Hintergrund |
| Phosphatase-Inhibitor-Cocktail | Roche Angewandte Wissenschaft | 4906845001 | Purpose_Application: Proteindephosphorylierung verhindern Specifications_Comments: Enthält Okadainsäure und Calyculin A |
| Vorgefärbte Proteinleiter | Bio-Rad | 1610394 | Purpose_Application: Molekulargewichts-Referenzstandards Specifications_Comments: 10-250 kDa Bereich mit 11 Bändern |
| Protease-Inhibitor-Cocktail | Roche Angewandte Wissenschaft | 11697498001 | Purpose_Application: Proteinabbau während der Lyse verhindern Specifications_Comments: EDTA-frei für metallabhängige Phosphatasen |
| PVDF-Membranen (0,45 & Icirc; ¼ m) | Millipore Sigma | IPVH00010 | Purpose_Application: Proteintransfermembran (0,45 & Icirc; ¼ m-Pore) Specifications_Comments: Niedriger Fluoreszenzhintergrund |
| RIPA Lysis-Puffer | Zell-Signaltechnik | 9806S | Purpose_Application: Ganzzell-Proteinextraktion Specifications_Comments: Fertiger Lysepuffer mit Reinigungsmitteln |
| Sample-Ladepuffer (4X) | Bio-Rad | 1610747 | Purpose_Application: Proteinprobenvorbereitung für SDS-PAGE Specifications_Comments: Farbstoff mit Î laden; ²-mercaptoethanol |
| SDS-PAGE Laufpuffer | Bio-Rad | 1610732 | Purpose_Application: Proteinelektrophorese Specifications_Comments: Tris-Glycin-SDS-Puffersystem |
| Natriumfluorid | Sigma-Aldrich | 201154 | Purpose_Application: Zusätzliche Phosphatase-Hemmung Specifications_Comments: 50 mM Arbeitskonzentration |
| Natrium-Orthovanadat | Sigma-Aldrich | S6508 | Purpose_Application: JAK2/STAT Phosphorylierungskonservierung Specifications_Comments: 1 mM Arbeitskonzentration, frisch vorbereiten |
| Pufferkonzentrat übertragen | Bio-Rad | 1704156 | Purpose_Application: Halbtrockener Proteintransfer Specifications_Comments: 10-fach konzentriert, vor der Anwendung verdünnen |
| Tris-Puffer-Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST) | Zell-Signaltechnik | 9997S | Purpose_Application: Membranwäsche und Antikörperverdünnung Specifications_Comments: 0,1 % Tween-20, pH 7,6 |
| CRISPR/Gene Editing | |||
| Calciumphosphat-Transfektions-Kit | Promega | E1200 | Purpose_Application: DNA-Transfektion in Verpackungszellen Specifications_Comments: Hohe Transfektionseffizienz bei der Lentivirusproduktion |
| DNA-Gel-Extraktionsset | Qiagen | 28706 | Purpose_Application: PCR-Produktreinigung für Sequenzierung Specifications_Comments: Säulenbasiertes Reinigungssystem |
| GV371 Lentiviralvektor | GeneChem Co., Ltd | GV371 | Purpose_Application: CRISPR/Cas9-Expression für Gen-Knockout Specifications_Comments: Praxisbereites CRISPR/Cas9-Lentiviralsystem |
| HEK293T Zelllinie | ATCC | CRL-3216 | Purpose_Application: Lentivirale Verpackungszelllinie Specifications_Comments: Hochtransfektierbare Verpackungszelllinie |
| Sanger Sequenzierungsdienst | Macrogen Inc. | Gewohnheit | Purpose_Application: Knockout-Validierung und Off-Target-Analyse Specifications_Comments: Standardsequenzierung mit individuellen Primern |
| T7-Endonuklease I | New England Biolabs | M0302S | Purpose_Application: CRISPR-Schnitteffizienz-Validierung Specifications_Comments: Mismatch-spezifische Endonuklease für CRISPR-Validierung |
| ELISA & Immunoassays | |||
| ELISA-Platten (96-Brunnen, flacher Boden) | Corning | 3590 | Purpose_Application: ELISA-Substratreaktion Specifications_Comments: Hochbindend, flacher Boden für ELISA |
| Human CLCF1 DuoSet ELISA | R& D-Systeme | DY1234 | Purpose_Application: CLCF1-Proteinquantifizierung (31,2–2000 pg/mL) Specifications_Comments: Nachweisbereich: 31,2–2000 pg/mL, CV & 10% |
| p24 ELISA Kit (lentiviraler Titer) | ZeptoMetrix Corporation | 801111 | Purpose_Application: Bestimmung lentiviraler Titer Specifications_Comments: Zur Bestimmung des lentiviralen Titers (>10â ¸ TU/mL) |
| funktionale Assays | |||
| Alizarin Red S Färbungsset | Sigma-Aldrich | A5533 | Purpose_Application: Calciumabscheidungsvisualisierung Specifications_Comments: 2 % Lösung in destilliertem Wasser, pH 4,1–4,3 |
| Alkalines Phosphatase-Aktivitätskit | Abcam | ab83369 | Purpose_Application: ALP-Enzymaktivitätsmessung Specifications_Comments: Kolorimetrischer Test, bei 405 nm gemessen |
| Ascorbinsäure (L-Ascorbinsäure) | Sigma-Aldrich | A4544 | Purpose_Application: Osteogene Mediumkomponente Specifications_Comments: 50 & Icirc; ¼ g/mL Endkonzentration |
| Cetylpyridiniumchlorid | Sigma-Aldrich | C9002 | Purpose_Application: Alizarin Red S-Extraktion zur Quantifizierung Specifications_Comments: 10%-Lösung für Farbstoffextraktion |
| Dexamethason | Sigma-Aldrich | D4902 | Purpose_Application: Osteogene Mediumkomponente Specifications_Comments: 10 nM Endkonzentration |
| Î ²-Glycerophosphat | Sigma-Aldrich | G9422 | Purpose_Application: Osteogene Mediumkomponente Specifications_Comments: 10 mM Endkonzentration |
| Osteogenes Differenzierungsmedium | PromoCell | C-28010 | Purpose_Application: Osteoblasten-Differenzierungsinduktion Specifications_Comments: Fertiges vollständiges osteogenes Medium |
| Transwell-Zellkultur-Einsätze (0,4 & Icirc; ¼ m) | Corning | 3470 | Purpose_Application: Kokultur-System mit 0,4 & Icirc; ¼ m-Trennung Specifications_Comments: Polyethylenterephthalatmembran, steril |
| Ausrüstung – Hauptinstrumente | |||
| Zentrifuge (Hochgeschwindigkeit, gekühlt) | Eppendorf | 5430R | Purpose_Application: Probenverarbeitung und Zelltrennung Specifications_Comments: Gekühlt, maximal 30.000 x g |
| Chemilumineszenzbildgebungssystem | Bio-Rad Labore | 12003154 | Purpose_Application: Western-Blot-Bildgebung und Quantifizierung Specifications_Comments: Gel-Dokumentation und Westlich-Blot-Bildgebung |
| CO2-Inkubator (befeuchtet) | Thermo Fisher Scientific | 51030287 | Purpose_Application: Zellkulturpflege (37Â ° C, 5 % CO2) Specifications_Comments: Dreifachgas (CO2/O2/N2), Feuchtigkeitskontrolle |
| Herzfrequenzmesser (Brustgurt) | Polarelektro | H10 | Purpose_Application: Kontinuierliche Herzfrequenzmessung Specifications_Comments: Bluetooth-Konnektivität & Acirc; &Plusmn; 1 bpm Genauigkeit |
| Hologic Discovery Ein DXA-Scanner | Hologic Inc. | Entdeckung A | Purpose_Application: Messung der Knochenmineraldichte Specifications_Comments: Mit APEX-Software v4.5 tägliche Qualitätskontrolle erforderlich |
| Mikroplattenleser (Multimode) | BioTek-Instrumente | Synergie H1 | Purpose_Application: ELISA-Plattenmessung und Absorptionsmessung Specifications_Comments: UV-Vis, Fluoreszenz, Lumineszenzdetektion |
| Motorisiertes Laufband | Lebensfitness | 95Ti | Purpose_Application: Standardisierte Trainingsintervention Specifications_Comments: Variable Geschwindigkeit 0–16 km/h, Gefälle 0–15 % |
| Echtzeit-PCR-System (CFX96 oder äquivalent) | Bio-Rad Labore | 1855195 | Purpose_Application: Echtzeit-PCR-Verstärkung und -Erkennung Specifications_Comments: 96-Well-Block, Gradientenfähig |
| Software & Analysetools | |||
| APEX Software v4.5 (DXA-Analyse) | Hologic Inc. | v4.5 | Purpose_Application: DXA-Scananalyse und BMD-Berechnung Specifications_Comments: BMD-Analyse mit Referenzdatenbank |
| Bio-Rad CFX Maestro | Bio-Rad Labore | CFX Maestro | Purpose_Application: qPCR-Datenanalyse und CT-Determination Specifications_Comments: Echtzeit-PCR-Analyse und Datenexport |
| GraphPad Prism v9.0 | GraphPad-Software | v9.0 | Purpose_Application: Statistische Analyse und Grapherstellung Specifications_Comments: Statistische Software mit Graphgenerierung |
| ImageJ/Fiji v1.53 | Nationale Gesundheitsinstitute | v1.53 | Purpose_Application: Westliche Blot-Densitometrie und Bildanalyse Specifications_Comments: Bildanalyse mit Messwerkzeugen |
| Microsoft Excel 365 | Microsoft Corporation | 365 | Purpose_Application: Datenorganisation und grundlegende Berechnungen Specifications_Comments: Datenorganisation und grundlegende statistische Funktionen |
| Verbrauchsgüter & Plastikwaren | |||
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhren | Eppendorf | 22363204 | Purpose_Application: Kleinvolumige Probenlagerung und -verarbeitung Specifications_Comments: DNase/RNase-frei, wenig bindend |
| 15-mL konische Röhren | Corning | 430766 | Purpose_Application: Mittelvolumen-Probenverarbeitung Specifications_Comments: Polypropylen, graduiert, mit Kappen |
| 24-Well-Zellkulturplatten | Corning | 3524 | Purpose_Application: Kokultur und funktioneller Assay-Aufbau Specifications_Comments: Gewebekultur behandelt, flacher Boden |
| 50 mL konische Röhren | Corning | 430829 | Purpose_Application: Großvolumige Probenentnahme und -verarbeitung Specifications_Comments: Polypropylen, graduiert, mit Kappen |
| Kryoviale (1 ml) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | Purpose_Application: Langzeitlagerung von Zellen und Proben bei -80 & Acirc; ° C Specifications_Comments: Außengewinde, O-Ringdichtung, -196Â ° C-Klassifizierung |
| Pasteur-Pipetten (steril) | Fisher Scientific | 13-678-20A | Purpose_Application: Sterile Probenentnahme und Transfer Specifications_Comments: Einzel verpackt, steril |
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