Dissektion von Drosophila melanogaster Indirekte Flugmuskulatur für Mikroskopie-Ansätze

Wir untersuchen die Muskelentwicklung, insbesondere wie die RNA-Regulation zur Sarkomerbildung und zur faserspezifischen Funktion bei Drosophila melanogaster beiträgt. Die indirekten Flugmuskeln werden während der Puppenentwicklung zusammengesetzt. Um diesen Prozess in vivo zu verfolgen, müssen technisch anspruchsvolle Dissektionsprotokolle entwickelt und optimiert werden.

Zu Beginn positionieren Sie einen Objektträger unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop. Verwenden Sie eine Plastikpipeette, um einen Tropfen PBS auf den Objektträger zu übertragen. Mit einem Pinsel oder einer Pinzette werden Drosophila-Fliegen in kleinen Gruppen auf die PBS-Tropfen übertragen.

Dann verwenden Sie eine Vannas-Federschere, um Kopf, Flügel und Bauch zu entfernen, während die Beine befestigt bleiben. Nun werden die Thoracen vorsichtig mit Hilfe einer Bürste auf 500 Mikroliter Fixierungslösung in einen Brunnen einer 24-Loch-Platte übertragen. Stellen Sie die Platte auf einen Nutator oder Schaukelschüttler und fixieren Sie die gewünschte Dauer, typischerweise zwischen 15 und 60 Minuten.

Mit einer P1000-Mikroliter-Pipette entferne den Puffer aus dem Brunnen. Geben Sie einen Tropfen von 0,05 % PBS mit Triton X-100 auf einen Objektträger unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop. Dann verwende eine Bürste oder eine Pinzette, um die Thorazen auf den PBST-Tropfen zu übertragen.

Orientieren Sie den Thorax mit dem Scutellum nach oben und stabilisieren Sie ihn zwischen einem Paar Dumont-3-Zangen. Als Nächstes schieben Sie eine Kryostat-Klinge über den Thorax, um das Scutellum einzukerben. Dann schneiden Sie in einem gleichmäßigen, nach unten verlaufenden Strich entlang der Mittellinie, um den Thoraxhemisektion zu erzeugen und die indirekten Flugmuskeln freizulegen.

Mit einer Zange werden Thoraxhemisektionen vom Objektträger auf 500 Mikroliter mit 0,05 % PBST in einen Brunnen einer 24-Bohrloch-Platte übertragen, um weiter verarbeitet zu werden. Um die indirekten Flugmuskeln der Puppen zu dissektionieren, sammeln Sie das Alter der Vorpuppen bis zum richtigen Zeitpunkt auf einem benetzten Filterpapier. Für Puppenhemithorax-Dissektionen legen Sie einen Streifen Doppelklebeband, der an einem Objektträger befestigt ist, unter ein Stereo-Dissektionsmikroskop mit 10- bis 20-facher Vergrößerung.

Zum gewünschten Zeitpunkt verwenden Sie einen Pinsel, um die Puppen vom Filterpapier auf das Klebeband zu übertragen. Öffnen Sie die Vorderseite des Puppengehäuses mit einer 5-Spanne und entfernen Sie vorsichtig das Operculum. Schneiden Sie vorsichtig entlang der Rückseite des Puppengehäuses auf und ziehen Sie es in 1 bis 2 Millimeter Ab.

Sobald sie aus dem Puppengehäuse befreit ist, übertragen Sie die Puppe vorsichtig auf einen Tropfen PBS auf einem zweiten Objektträger. Benutze jetzt eine Vannas-Federschere, um den Bauch zu entfernen. Mit einer Bürste oder einer Pinzette wird Kopf und Thorax auf 500 Mikroliter Fixationslösung in eine Mulde einer 24-Well-Platte übertragen.

Nach der Fixierung und Entfernung der Fixationslösung wird die Thorthese auf einen Tropfen von 0,05 % PBST auf einem Objektträger übertragen. Trennen Sie einen Thorax vom Rest und orientieren Sie ihn mit der Bauchseite nach unten, stabilisiert zwischen Dumont-3-Zangen. Schieben Sie eine Kryostat-Klinge über den Thorax, bis die Basalmembran und die Nagelhaut aufgeschnitten sind.

Dann schneiden Sie in einem sanften, abwärts verlaufenden Strich entlang der Mittellinie ab, um Thoraxhemisektionen zu erzeugen und die indirekten Flugmuskeln freizulegen. Verwenden Sie einen Pinsel oder eine Pinzette, um Hemisektionen auf 500 Mikroliter 0,05 % PBST in einer 24-Well-Platte für weitere Färbung zu übertragen. Für die Open-Book-Dissektion der indirekten Flugmuskeln werden die Puppen nach dem Entfernen aus dem Puppengehäuse in eine schwarze Silikon-Dissektionsschale mit PBS übertragen.

Mit einer Dumont-5-Pinzette drücken Sie die dissektionierten Puppen vorsichtig auf die Oberfläche der Schale und führen Sie zwei Insektennadeln durch den Bauch jeder Puppe, um sie in einer Linie zu sichern. Mit einer Vannas-Frühlingsschere schneidet man die Basalmembran und den vorderen Kopfbereich jeder Puppe auf. Jetzt stecken Sie die Schere in die Öffnung und schneiden Sie an den Seiten der Puppe entlang.

Verwenden Sie eine Pinzette, um den Bauchbereich mit einer Schere anzuheben und zu entfernen. Dann werden Gehirn, ventrale Nervenmark, Luftröhre und Darm entfernt. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um PBS sanft über den Thorax zu pipettieren und die verbleibenden Fettkörper zu entfernen.

Dann benutzt man eine Vannas-Federschere, um die Mittellinie des dorsalen Thorax abzuschneiden und so zwei Blättchen mit indirekten Flugmuskeln zu erzeugen. Schneiden Sie die Blättchen des dorsalen Thorax vom Bauch weg und geben Sie sie mit einer Dumont-5-Zange in 300 Mikroliter fixierende Lösung in eine schwarze Glasschale. Nach der Fixierung für die entsprechende Zeit verwenden Sie eine Pipette zum Entfernen des Fixativs und Waschen Sie in 500 Mikrolitern 0,05 % PBST vor der Immunfärbung.

Sobald die Immunfärbung abgeschlossen ist, pipettieren Sie die Sekundär- oder Färbemischung aus. Anschließend werden die Proben jeweils viermal für 10 Minuten in 0,05 % phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Triton X-100 bei Raumtemperatur gewaschen. Beschriften Sie den frostigen Bereich eines Objektträgers mit der Probennummer oder identifizierenden Informationen wie Datum, Genotyp, Antikörper oder Objektträgernummer.

Pipettiere einen Tropfen Glycerol auf den Objektträger, um Abstandshalter zu sichern. Dann positioniere 1 Abstandsabstand auf dem Objektträger des Mikroskops etwa 1 Zentimeter auseinander. Gib jetzt einen Tropfen Montagemedium zwischen die Abstandshalter.

Pipettieren Sie eventuelle Restwasserpuffer und übertragen Sie sofort die Proben in das Montagemedium. Mit der Dumont-5-Zange werden die Proben in nicht überlappende Reihen und Spalten organisiert, wobei die indirekten Flugmuskeln nach oben zeigen. Füge vorsichtig einen Deckzettel über die Proben.

Als Nächstes wird die Probenfläche mit Montagemedium gefüllt, bis alle Thorthese eingeschlossen sind. Anschließend verwenden Sie klaren Nagellack, um sowohl den Probendeckel als auch den Abstandshalter zu versiegeln. Die Sarkomermorphologie wurde effektiv mit 4%-Paraformaldehyd erhalten, aber ein signifikanter Unterschied in der Sarkomerbreite zwischen Paraformaldehyd und PBS wurde im Vergleich zur entspannenden Lösung festgestellt.

Die Methanolfixierung bewahrte Myofaser- und Sarkomerstrukturen, aber die Sarkomere waren deutlich kürzer und dünner als die 4%-PFA-Fixierung. Die Glyoxalfixierung reduzierte die Sarkomerbreite im Vergleich zu 4%-Paraformaldehyd signifikant. Eine Fixierung von 15 oder 30 Minuten bewahrte die Sarkomerstruktur, aber eine siebenminütige Fixierung führte zu inkonsistenten Morphologien.

Die myofibrillale Struktur der indirekten Flugmuskeln wirkt durch stumpfe Klingen oder Blattrutschen ausgefranst und gerissen. Der direkte Kontakt mit den Muskeln führte zu Vertiefungen oder Dehnungen, wodurch die Sarkomeren auseinandergezogen wurden. Dehnung oder Thoraxdeformation führte zum Verlust der Z-Scheibe.

Das Sägen der Fasern führte zum Auflösen. 72 Stunden nach der Puparienbildung und im Erwachsenenstadium fehlten SmnE33-Mutanten Sarkomere, mit reduzierten F-Aktin- und Starburst-Bündeln. 26 Stunden nach der Pupariumsbildung zeigten SmnE33 und die Kontrollen ähnliche SmnE33-Kabel und Mesh-Netzwerke.

Wir erhielten Protokolle für die Immunfluoreszenzmikroskopie der indirekten Flugmuskeln bereits 16 Stunden nach der Puparbildung, bis hin zur späten Puppenentwicklung und im Erwachsenenstadium. Unser Protokoll ermöglicht es uns, molekulare Phänotypen und zelluläre Defizite im Zusammenhang mit der Proteinlokalisierung sowie der Muskelstruktur und -funktion zu betrachten, die meist zu Verhaltensdefiziten führen.