Name: Shrinky-Dink hängende Tropfen: Ein einfacher Weg zu Form und Kultur Embryoid Bodies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Lernen Sie eine einfache Methode zur kontrollierten Bildung von Embryoid Bodies in mikrofabrizierten Wells. Diese Technik reduziert den manuellen Arbeitsaufwand erheblich und ermöglicht präzise Kontrolle über die Zellzahl für reproduzierbare Stammzellforschung.

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Wir möchten CIRM für die Unterstützung dieser Arbeit danken. Die Zelllinie wurde großzügig von Dr. Andras Nagy am Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario gespendet.

1. Machen Shrinky-Dink Mold <ol><li> Drucken Sie das gewünschte Muster auf Shrinky-dink Blatt mit einer guten Definition Drucker. </li><li> Bake Shrinky-dink Blatt bei 163 ° C etwa 10 Minuten, oder bis es vollständig geschrumpft und erworben haben eine regelmäßige Form. </li><li> Nach Shrinky-dink Form abgekühlt ist, tauchen Sie es in einem Isopropanol-Bad, bis die gesamte Oberfläche ist kaum abgedeckt. </li><li> Vorsichtig Spray etwas Aceton über die Form und schütteln Container ein paar mal. Fügen Sie weitere Isopropanol auswaschen Aceton Exzess und wiederholen Sie diesen Schritt ein paar Mal, bis Shrinky-mold sieht sauber. </li><li> Tauchen Schimmel in destilliertem Wasser für 10 Minuten abwaschen verbleibende organische Lösungsmittel. </li><li> Air sauber Shrinky-Form. Re-heat es für etwa 5 Minuten bei 163 ° C. Dadurch wird kompakt Tinte und verdampfen alle verbleibenden Lösungsmittel. </li></ol> 2. Machen PDMS Kavitäten <ol><li> Bereiten Sie eine 10:1-PDMS / Härter-Gemisch, und schütteln kräftig für wenige Minuten. </li><li> Legen Sie Shrinky-dink Schimmel in eine kleine Petrischale. Gießen PDMS-Mischung, bis sie über 1 / 2 cm über der Oberfläche der Form erreicht. </li><li> Legen Gericht unter Vakuum Glocke um alle Luft aus PDMS-Mischung zu beseitigen. </li><li> Legen Gericht im Ofen bei 70 ° C, über Nacht. </li><li> Cut off feste PDMS von Schimmel und binden ihn an einen Glasträger nur durch Anwendung von Druck. </li><li> Discard ersten Mikrotiterplatten-Chip, da es Farbreste zwischen PDMS verkrustet ist. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem zweiten Chip, der Ink-frei ist und hat eine definierte Form zu produzieren. </li><li> Saubere Mikrotiterplatten-Chip mit 70% Ethanol-Lösung. Legen Sie sie unter UV-Lichtquelle für 10 Minuten, um es zu sterilisieren. </li></ol> 3. Trapping-Zellen in Mikrotiterplatten <ol><li> Zählen von Zellen und verdünnen sie in Kulturmedien auf die gewünschte Konzentration (je nachdem, wie viele erste Zellen in Vertiefungen möchten). Zum Beispiel, um etwa 10-15 Zellen pro Well (Durchschnitt = 11, SD = 5,4, loading rate = 93%) zu erhalten, verwendeten wir eine Konzentration von 8 x 10 4 Zellen / ml. Bei einer Konzentration von 17 × 10 4 Zellen / ml, könnten wir sicher bekommen zwischen 25 und 35 Zellen pro Well (Durchschnitt = 27,17857 SD = 7,7, loading rate = 100%). </li><li> Vorsichtig Mikrotiterplatten-Chip in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit einer verfestigten PDMS Basis. </li><li> Fügen Sie über 2JDP ml der Zell-Lösung. </li><li> Zentrifuge für 5 Minuten bei 760 rpm und 4 ° C. </li><li> Pipet überschüssige Lösung und sorgfältig zu waschen Mikrotiterplatten mit PBS 1X-Lösung. </li><li> Legen Mikrotiterplatten in einer kleinen Schüssel Petry, wobei darauf geachtet während der Einnahme der Chip aus dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wash Zelle mehr mit 1 X PBS-Lösung. </li><li> Legen Mikrotiterplatten-Chip unter einem inversen Mikroskop bestimmt Anzahl von Zellen pro Vertiefung zu überprüfen. </li><li> Inkubieren Mikrotiterplatte enthaltenden Zellen bei Standardbedingungen. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Abbildung-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. Zellinkubation <ol><li> Folgen Sie den normalen EB-Protokoll in das Labor. </li><li> Ändern Sie das Medium langsam von der Seite der Kammer; stören die Zelle in die Vertiefungen. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Wir haben eine einfache, schnelle und skalierbare Methode zur Kultur vordefinierten Anzahl von Zellen in mikrostrukturierten Vertiefungen (geformt aus Shrinky-Dinks) zu laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung entwickelt. Schließlich sind diese Zellen leicht zugänglich für weitere Analysen und Experimente. Diese Methode ist offen für jedes Labor und erfordert keine spezielle Ausrüstung, weil wir die Notwendigkeit für die Photolithographie zu vermeiden. Wir können variieren die Größe der Kavitäten sowie die Konzentration der Zelle...

Für die MESC Medien (McCloskey Labor-Protokoll): (für insgesamt Medien vorbereitet: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7,5 ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5 ml; 1ml 2mM L-Glutamin: 0,5 ml; 1ml NEAA: .5 ml; 1ml LIF: 100 ul; 200 &amp;mgr; l BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100 ul verwässerte BME:. 50ul; 100 ul (Add 35ul der sterilfiltriert BME zu 5 ml PBS und Spritzenfilter sterilisieren Discard nach 2 Wochen. Endkonzentration in der Lösung ist .1 mm)

shrinky-dink hängende tropfen: ein einfacher weg zu form und kultur embryoid bodies

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid Körper (EB) sind Aggregate aus embryonalen Stammzellen. Die häufigste Art der Erstellung dieser Aggregate ist der hängende Tropfen-Methode, eine mühsame Annäherung Pipettieren eine beliebige Anzahl von Zellen in Mikrotiterplatten. Die Wechselwirkungen zwischen den Stammzellen in unmittelbarer Nähe voneinander gezwungen fördert die Generation der EBS. Weil die Medien in jede der Vertiefungen muss manuell ausgetauscht werden jeden Tag, ist dieser Ansatz manuell intensiv. Darüber hinaus, weil Umwelt-Parameter einschließlich Zell-Zell-, Zell-löslichen Faktor-Interaktionen, pH und Sauerstoff Verfügbarkeit kann Funktionen der EB groß sein, können Zellpopulationen aus traditionellen hängende Tropfen erhalten dramatisch unterscheiden, auch wenn unter identischen Bedingungen kultiviert. Jüngste Studien haben zwar gezeigt, dass die anfängliche Anzahl von Zellen bilden das Aggregat kann erhebliche Auswirkungen auf Stammzell-Differenzierung haben. Wir haben eine einfache, schnelle und skalierbare Methode zur Kultur vordefinierten Anzahl von Zellen in mikrofabrizierten Brunnen laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung entwickelt. Schließlich sind diese Zellen leicht zugänglich für weitere Analysen und Experimente. Diese Methode ist offen für jedes Labor und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Wir demonstrieren diese Methode, indem Embryoidkörpern mit einem rot fluoreszierenden Maus-Zelllinie (129S6B6-F1).

Wir zeigen eine einfache und schnelle Methode, um vordefinierte Anzahl von Zellen in mikrofabrizierten Brunnen laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung.

Shrinky-Dink hängende Tropfen: Ein einfacher Weg zu Form und Kultur Embryoid Bodies

Embryoide Körper (EB) sind Aggregate aus embryonalen Stammzellen. Die gängigste Methode zur Herstellung dieser Aggregate ist die Hanging-Drop-Methode, ein mühsames ...

Embryoidkörper sind Aggregate aus embryonalen Stammzellen. Die gebräuchlichste Methode zur Erzeugung dieser Aggregate ist die Hänge-Tropfen-Methode. Eine mühsame Vorgehensweise, bei der eine willkürliche Anzahl von Zellen mittels Pipette in Muldenplatten überführt wird.Der Prozess ist manuell aufwändig, da das Medium und jede Wellschale täglich manuell gewechselt werden müssen. Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass die anfängliche Anzahl von Zellen, die das Aggregat bilden, Auswirkungen auf die Differenzierung von Stammzellen haben kann. Mit dieser Methode ist es nicht möglich, die Anzahl der Zellen vorherzubestimmen.In diesem Video zeigen wir eine einfache und schnelle Methode, verschiedene Zellzahlen in mikrofabrizierte Vertiefungen zur Entwicklung von Embryoidkörpern einzubringen. Hallo, ich bin Jonathan Pagan aus dem Labor von Michelle K in der School of Engineering der University of California Merced, und ich bin Jesus Luna, ebenfalls aus dem K-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Embryoidkörpern in mikrofabrizierten Vertiefungen mittels Zentrifugation.Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Erstellen eines Mikrogeräts, Beladen d

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt, wie in vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus, um Embryoidkörpern mit dem hängenden Tropfen-Methode durchzuführen.

In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

Wir beschreiben eine einfache, schnelle Methode zur Erzeugung von 3D-Gewebe-like Sphäroide und ihre mögliche Anwendung auf Unterschiede in der Zell-Zell-Interaktionen zu quantifizieren.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Dieses Video zeigt einen Assay zur Erzeugung von zerebralen Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Humane iPSCs werden dazu angeregt, Embryoidkörper (EBs) zu bilden. Die EBs werden unter Verwendung eines Induktionsmediums über einem Polymergerüst kultiviert, wodurch die Differenzierung in neurale Stammzellen, Vorläuferzellen und unreife Neuronen gefördert wird. Schließlich werden die EBs in eine Matrix eingebettet und in ein Erhaltungsmedium für die Bildung von zerebralen...

Generierung von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten zerebralen Organoiden

Dieses Video zeigt den Prozess der Erzeugung von Neuronenkugeln mit einer Hanging Drop-Kulturtechnik. Innerhalb der hängenden Tropfen bewegen sich die Zellen nach unten, sich selbst zu dreidimensionalen Strukturen zusammengefügt und bilden Neuronenkugeln, die für neurobiologische Studien verwendet werden können.

Entwicklung von Neuronenkugeln mit einer Hanging Drop Culture-Technik

Das Video zeigt die Differenzierung von embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus zu Embryoidkörpern (EBs) durch die Hanging Drop-Methode. Nach dem Suspendieren der mES-Zellen in hängenden Tropfen und der Inkubation aggregieren die Zellen zu EBs, die unter Verwendung eines mit Retinsäure (RA) ergänzten Differenzierungsmediums weiter zu neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) differenziert werden.

Generierung neuronaler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit der Hanging Drop-Methode

Dieses Video zeigt den Prozess der Differenzierung von embryoiden Körpern (EBs) in neuroepitheliale Aggregate und deren anschließende Aufteilung in neuronale und gliale Zellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Erzeugung von neuronalen und glialen Zellen in vitro, die als Testsysteme für Toxizitätstests sowie zur Bewertung verschiedener Signalwege dienen, die an der Neurotoxizität beteiligt sind.

Erzeugung von Neuronen und Gliazellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Embryoidkörpern

Dieses Video zeigt die Verwendung einer lateralen Soft-Light-Beleuchtungstechnik, um die Visualisierung von Embryoidkörpern mit bloßem Auge zu verbessern und dadurch deren Manipulation und Übertragung während der zerebralen Organoidkultur zu erleichtern. Es werden der Aufbau der sanften Lichtbeleuchtung, Methoden für Medienveränderungen und Embryoidkörpertransfer sowie das Verfahren zur Induktion der neuronalen Differenzierung in Embryoidkörpern für die Entwicklung zerebraler Organoide...

Eine Technik zur Optimierung der zerebralen Organoidkultur unter Verwendung von lateraler Soft-Light-Beleuchtung

Die ex vivo aufrechte Tröpfchenkultur ist eine Alternative zu den derzeitigen in vitro und in vivo experimentellen Techniken. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert kleinere Mengen an Reagenzien, ermöglicht aber die Manipulation und Untersuchung der fetalen Vaskularisation, Morphogenese und Organogenese.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Nierenorganoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs). Dieses Protokoll erzeugt Nierenorganoide innerhalb von zwei Wochen. Die resultierenden Nierenorganoide können in großflächigen Spinnerkolben oder magnetischen Multi-Well-Rührplatten für parallele Drogentestansätze kultiviert werden.

Eine vereinfachte Methode zur Erzeugung von Nierenorganoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen

Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Generierung und nachgelagerte Analyse von menschlichen Gehirnorganoiden mittels Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierung vor.

Generierung und Downstream-Analyse von Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomen in Hirnorganoiden

Lernen Sie eine einfache Methode zur kontrollierten Bildung von Embryoid Bodies in mikrofabrizierten Wells. Diese Technik reduziert den manuellen Arbeitsaufwand erheblich und ermöglicht präzise Kontrolle über die Zellzahl für reproduzierbare Stammzellforschung.

Shrinky-Dink hängende Tropfen: Ein einfacher Weg zu Form und Kultur Embryoid Bodies

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