Ein neonatales Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis und der Isolierung von Lamina propria für die Erstellung von Immunzellprofilen

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Krankheit, die medizinisch empfindliche Säuglinge betrifft und als nekrotisierende Enterokolitis bezeichnet wird. Unser Ziel ist es, die Mechanismen der Immunantwort im NEC aufzudecken und Strategien zur frühzeitigen Diagnose und Prävention der Krankheit zu entwickeln. Es ist sehr herausfordernd, die Antworten der intestinalen Immunzellen im neonatalen NEC zu untersuchen. Unser Protokoll schließt diese Lücke, indem es demonstriert, wie Lamina-propria-Immunzellen für die Analyse mittels Durchflusszytometrie isoliert werden können.

Zu Beginn sollten Sie eine Kultur enterischer Bakterien aufnehmen, die von einem Säugling mit nekrotisierender enterocolitis totalis, oder NEC, kultiviert wurde. Am Versuchstag 0 um 15:00 Uhr pipettieren Sie einen 20-Mikroliter-Aliquot der Kultur in ein 15-Milliliter-Kulturröhrchen mit 2 Millilitern Luria-Bertani-Brühe. Inkubieren Sie die Bakterienkultur 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem auf 1G eingestellten Orbitalshaker, wobei der Schlauchdeckel in einer belüfteten Position bleibt.

Gleichzeitig wird ein zweites Kulturrohr mit nur 2 Millilitern Luria-Bertani-Brühe als Kontrolle inkubiert, um auf Kontaminationen zu prüfen. Am nächsten Tag um 7:00 Uhr pipettieren Sie 125 Mikroliter der nächtlichen Bakterienkultur in eine T75-Zellkulturkolbe mit belüftetem Deckel und 25 Millilitern Luria-Bertani-Brühe. Bereiten Sie insgesamt vier T75-Flaschen vor und inkubieren Sie zwei Stunden lang in einer aufrechten Position bei 37 Grad Celsius in einem auf 1G eingestellten Orbitalshaker.

Um 9:00 Uhr an den Versuchstagen 1, 2 und 3 werden 16 Milliliter Säuglingsnahrung mit 8 Millilitern Welpenmilch in einem sterilen 50-Milliliter-Zentrifugenrohr kombiniert, um die Formelmischung herzustellen. Entfernen Sie das Supernatant aus zwei 50-Milliliter-Zentrifugenröhren, die die pelletierte Bakterienkultur enthalten. Lassen Sie beide Pellets gründlich in 2 Millilitern der vorbereiteten Säuglingsmischung aufhängen.

Dann werden beide umgeworfenen Mischungen in die verbleibende Formelmischung übergeben, sodass insgesamt 24 Milliliter NEC-Formel entstehen. Beschriften Sie sechs 50-Milliliter-Zentrifugenröhren mit den sechs Fütterungszeitpunkten. Pipettieren Sie 4 Milliliter der NEC-Formel in jedes der sechs beschrifteten Röhren.

Als Nächstes bereiten Sie sechs Einweg-Aliquoten von Lipopolysaccharid mit 5 Milligramm pro Milliliter vor und lagern Sie sie in Mikroröhren mit niedriger Bindung bei 20 Grad Celsius. Kurz vor dem Füttern ein Lipopolysaccharid Aliquot und Vortex für 15 Sekunden auftauen. Gib ein berechnetes Volumen des Lipopolysaccharids zu einer 4-Milliliter-NEC-Formelröhre und vermische sie gut durch Pipetten.

Füllen Sie eine 1-Milliliter-Spritze mit der vorbereiteten NEC-Formel und befestigen Sie sie an eine neonatale PICC-Leitung. Um jedem Welpen die NEC-Formel oral zu verabreichen, halten Sie ihn vorsichtig an der lockeren Haut an der Halsbasis fest und halten Sie ihn aufrecht. Der Einführungsabstand der PICC-Leitung entspricht dem Abstand vom Mundwinkel bis zur Oberseite des Milchflecks im Magen.

Der optimale Einstichpunkt auf der PICC-Leitung sollte mit einem permanenten Marker markiert werden. Mit einer Pinzette führen Sie die PICC-Leitung in den Oropharynx und hinunter in den Magen. Wenn Widerstand auftritt, entfernen Sie die PICC-Leitung, positionieren sie neu und versuchen Sie die Wiedereinführung.

Gib langsam 80 Mikroliter NEC-Formel in den Magen. Beobachten Sie den Welpen während des Fütterns auf Anzeichen von Aspiration. Nach dem Füttern entfernen Sie die PICC-Leine und beobachten Sie den Welpen auf schwere Atmung oder Erbrechen.

Falls es zu Erbrechen kommt, tupfen Sie Mund und Nase des Welpen mit einem Labortuch mit wenig Fusseln ab. Wiederholen Sie den Fütterungsvorgang zu allen Fütterungszeitpunkten. Am Versuchstag 4 entnehmen Sie das Darmgewebe von den eingeschläferten Neugeborenenmäusen.

Mit einer Schere schneidet man den Darm längs durch, um ihn zu öffnen, und schneidet ihn dann quer in 1–1,5 Zentimeter große Segmente. Überführen Sie die Darmsegmente in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr mit 10 Millilitern Vorverdauungslösung, das auf Eis abgekühlt wurde. Dann inkubiert man den Röhre bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlicher Rotation für 20 Minuten, um mit der Gewebedissoziation zu beginnen.

Bewegen Sie das Rohr vorsichtig, um das gelockerte Gewebe zu lösen, und gießen Sie den Inhalt dann durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb, das auf ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr gelegt wird. Transferiere die verbleibenden Gewebefragmente in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenrohr mit 10 Millilitern Verdauungslösung, vorgeheizt auf 37 Grad Celsius. Inkubieren Sie die Probe in kontinuierlicher Rotation für 40 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Dann werden die Inhalte in ein automatisiertes Gewebedissoziationsrohr übertragen. Führe das Programm mit vier 15-sekündigen Rotationszyklen abwechselnd im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn aus. Wenn die Dissoziation abgeschlossen ist, wirbeln Sie die Zellsuspension im Dissoziationsröhrchen vortex und zentrifugieren Sie sie dann bei 300 G für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.

Saugen Sie das Supernatant vorsichtig ein, ohne das Pellet zu stören. Die Zellen in 1 Milliliter eiskaltes, fluoreszenzaktivierter Zellsortierpuffer wieder suspendieren. Setzen Sie ein 100-Mikrometer-Sieb über ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr.

Übertragen Sie die resuspendierten Zellen durch das Sieb und waschen Sie sie mit 2 Millilitern kaltfluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer. Zählen Sie die isolierten Zellen und bewerten Sie die Lebensfähigkeit mit Trypanblau oder einem Lebensfähigkeitsfarbstoff. Zentrifugieren Sie das gewünschte Volumen für die Durchflusszytometrie bei 300 G für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.

Eine signifikante Reduktion des Überlebens in der NEC-Behandlungsgruppe wurde im Vergleich zu den damgefütterten Kontrollgruppen beobachtet. Die Makro-Darmuntersuchung von NEC-Mäusen zeigte charakteristische Merkmale von NEC, darunter sichtbare Anzeichen von Dehnung, Luftansammlung und Pneumatose-Darmintestinalis im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Die Färbung von Hämatoxylin und Eosin zeigte bei NEC-Mäusen eine fleckige Villuszerstörung und eine gestörte Darmarchitektur im Vergleich zu intakten Villi bei Kontrollen.

Die Expression von IL1B-, CXCL2- und LCN2-Boten-RNA war in der NEC-Gruppe signifikant höher als bei Kontrollen. Die Gesamtzahl der CD45+Immunzellen in der intestinalen Lamina propria unterschied sich nicht signifikant zwischen NEC- und Kontrollgruppen. Die Makrophagenspiegel waren im NEC-Darm im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant erhöht.

NEC-Mäuse zeigten einen erhöhten Anteil myeloischer Zellen, insbesondere Monozyten und Makrophagen, im Vergleich zu anderen Immunsubtypen. Einzellige Multiomik-Ansätze decken Immunzellsignaturen in NEC auf und bieten neue Einblicke in Mechanismen und potenzielle Biomarker. Die Modellierung von NEC ist schwierig, da die Krankheit multifaktoriell ist.

Die Nachbildung der menschlichen Darmumgebung, der Immunantworten und mikrobiellen Einflüsse bei Neugeborenenmäusen erfordert sorgfältige Optimierung. Unser Modell integriert vom Menschen abgeleitetes Mikrobiom, Hypoxie und Nahrungsnahrung, was es physiologisch relevant macht und für detaillierte Immunzellprofilierungen bei Neugeborenenmäusen ausgerichtet ist.