Beurteilung der mitochondrialen Spaltungs-/Fusionsdynamik in proximalen tubulären Zellen der Niere

In unserem Labor wollen wir Mitochondrien in verletzte Organe transplantieren, um sie zu heilen. Deshalb entwickeln wir ein neues Betriebsprotokoll, um effiziente und dynamisch aktive Mitochondrien zu isolieren. Herausforderungen bestehen darin, transplantierte Mitochondrien ohne Färbung zu verfolgen und gleichzeitig deren Integration, Funktionalität und dynamisches Verhalten mit ihren neuen Empfängerzellen genau zu bewerten.

Um mit der Samen-Niere-Proximalröhrenzelle in Glasbodenkulturplatten zu beginnen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht, um Haftung und Wachstum zu ermöglichen. Am nächsten Tag wird Cisplatin zur Versuchsplatte hinzugefügt, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolaren zu erreichen.

Anschließend werden die Laser eines konfokalen Mikroskops auf 405 Nanometer, 488 Nanometer für unkonvertierte Dendra2-Anregung und 561 Nanometer konfiguriert. Schalten Sie die Laser ein und lassen Sie etwa 10 Minuten zur Stabilisierung ein. Setze die Kulturscheibe in die Brutkammer.

Füge Wasser rund um die Kammer hinzu und stelle die Temperatur auf 37 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die Kohlendioxidversorgung aufrechterhalten bleibt. Lassen Sie die Inkubationskammer vor der Bildgebung gleich ausgleichen. Visualisieren Sie die Zellen mit höherer Vergrößerung und Auflösung für die mitochondriale Bildgebung.

Öffnen Sie das Dropdown-Menü oben links und wählen Sie die FRAP-Optionen aus. Mit der LAS X-Software werden die Interessensgebiete definiert, in der das Fotobleichen durchgeführt wird. Wenden Sie nun einen hochintensiven Laserpuls an, um den Interessenbereich zu bleichen, indem FRAP-Laser auf 405 Nanometer bei 4,00 und 488 Nanometer bei 0,00 eingestellt werden.

Und 561 Nanometer bei 0,00. Stellen Sie die Vorbleichzeit auf 5,140 Sekunden für 59 Iterationen ein und definieren Sie das Timing nach dem Bleichen. Für die Nachbleichbildgebung werden weiterhin Bilder mit niedriger Laserintensität für 10 Minuten mit FRAP-Lasern in 405 Nanometern bei 0,00 und 488 Nanometern bei 0,50 aufgenommen.

Und 561 Nanometer bei 0,50. Um die verschmolzenen grünen und roten Mitochondrien zu profilieren, installieren Sie zunächst das RGB Profiler Plug-in. Öffnen Sie die ImageJ-Software und suchen Sie dann im Dateimenü die Bilddatei und öffnen Sie sie zur Analyse.

Wählen Sie den Farbmodus Composite, aktivieren Sie die Option Autoscale und öffnen Sie den Video- oder Bildstack zur Analyse. Zeichne einen rechteckigen Bereich über dem Bild und klicke mit der rechten Maustaste, um Duplizieren auszuwählen. Wählen Sie die Option Hyperstack duplizieren, um alle Bildstapel zu duplizieren.

Wählen Sie das Bild aus und wählen Sie im Bild-Dropdown-Menü RGB, um den duplizierten Stack in das RGB-Format umzuwandeln. Dupliziere das RGB-Bild und wähle nur ein Bild aus. Wenn die Mitochondrien gekrümmt erscheinen, ziehen Sie eine Linie entlang ihrer Länge, gehen Sie dann zum Bearbeiten-Menü, wählen Sie Auswahl und klicken Sie auf Gerade.

Wählen Sie nun einen Titel für das geradegemachte Bild und setzen Sie die Linienbreite auf 20 Pixel. Ziehen Sie eine Linie entlang des begradigten Mitochondriums, um es richtig auszurichten. Und öffne das RGB Profiler-Plugin.

Nach der Aktivierung erzeugt das Plug-in ein Diagramm mit roten und grünen Fluoreszenzintensitäten entlang der gezogenen Linie. Die Höhe jedes Peaks ist direkt proportional zur Fluoreszenzintensität. Nach der Fusion wird bestätigt, dass die rote Fluoreszenz sich in das benachbarte grüne Mitochondrion ausgebreitet hat, was auf die Mischung des Inhalts hinweist.

Überprüfen Sie, dass das Intensitätsdiagramm nun überlappende rote und grüne Spitzen zeigt. Um die Fusion zu beurteilen, wählen Sie gesunde Mitochondrien und photogebleichte Mitochondrien für die Fusion in der Lebendzellbildgebung aus. Überwachen Sie die Veränderung des rot-grünen Fluoreszenzverhältnisses über die Zeit, um Fusionsereignisse anzuzeigen.

Kontrollzellen zeigten längliche Mitochondrien mit gelber Matrix, was auf eine mitochondriale Verschmelzung der roten und grünen Matrizen hinweist. Cisplatin-behandelte Zellen zeigten fragmentierte Mitochondrien mit reduzierter Überlappung von roten und grünen Signalen, was auf eine beeinträchtigte Fusion hindeutet. Die Fluoreszenzwiederherstellung im photobleichten Bereich nahm im Laufe der Zeit in den Kontrollzellen ab, was auf eine aktive mitochondriale Fusion hinweist.

Mit Cisplatin behandelte Zellen behielten ein nahezu stabiles Fluoreszenzverhältnis, was auf eine beeinträchtigte Mitochondrienfusion hinweist. Die Expression von CLRS-1 war in cisplatin-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant reduziert. Die Verwendung von Zellexpression von Fluoreszenz und photoschaltbaren Mitochondrien hilft uns, Mitochondrien zu verfolgen und ihre Dynamik in den Empfängerzellen zu bewerten.

Die Morphologie lebender Mitochondrien zeigt die Zellgesundheit in Echtzeit, Gen-Tagging und fotoschaltbare Proteine erhöhen die Genauigkeit und Robustheit. Zukünftige Forschungen werden zelluläre Maschinen, sowohl mitochondrische als auch zytoplasmatische, die die Umgestaltung koordinieren, um röhrliche, kugelförmige oder kreisförmige Mitochondrien zu formen.