Lebendzell-Bildgebung des endozytären Transports mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen

Wir untersuchen den endozytischen und retrograden Verkehr von transmembranen Proteinen sowie die Maschinerie, die den Transport ermöglicht. Zur Untersuchung des Proteinverkehrs von der Zelloberfläche werden typischerweise konventionelle Antikörper verwendet, die jedoch Quervernetzung und lysosomale Zielsteuerung fördern können. Um zu beginnen, erhalten Sie ein Pellet mit Escherichia coli-Bakterien, das mit VHH-mCherry transformiert wurde.

Fügen Sie 30 Milliliter eiskalten Bindungspuffer mit 20 millimolaren Imidazol in PBS zur bakteriellen Zellpellet hinzu. Mit einer Pipette wird das Pellet gründlich durch Pipettieren auf und ab aufgehängt wieder. Übertragen Sie das neu suspendierte Gemisch in ein beschriftetes 50-Milliliter-Zentrifugenrohr.

Ergänzen Sie die resuspendierten Zellen mit 200 Mikrogramm Lysozym pro Milliliter, 20 Mikrogramm pro Milliliter DNase I, einem millimolaren Magnesiumchlorid und einem millimolaren Phenylmethylsulfonylfluorid. Nach dem 10-minütigen Inkubieren des Röhrchens bei Raumtemperatur setzen Sie ihn auf einen Rotator über das Ende und setzen Sie die Inkubation bei vier Grad Celsius für eine Stunde fort. Anschließend wird eine sechs Millimeter große Festprobespitze des Sonikators direkt in die Zellsuspension eingeführt.

Mechanische Störung der Bakterienzellen mit drei einminütigen Sonikationsimpulsen bei 40 % Amplitude und einem Duty Cycle von einer Sekunde Ein- und einer Sekunde Aus. Es gibt ein einminütiges Abkühlintervall zwischen jedem Impuls. Nach der Zentrifugation wird das gereinigte Lysat auf Eis gelassen, während die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie mit vorverpackten, einmaligen Tag-Reinigungssäulen für den Gravitationsfluss vorbereitet wird.

Befestigen Sie Nickel-Nitrilotriassitsäure-Säulen auf einem Metallsockel oder an einem geeigneten Säulenhalter. Dann lasse den Speicherpuffer komplett aus der Säule ab. Gleichgewicht der Säule an, indem Sie 10 Milliliter Bindungspuffer mit 20 millimolaren Imidazol in PBS hinzufügen.

Lass den Puffer durch die Schwerkraft durchziehen. Tragen Sie nach und nach etwa 30 Milliliter des gereinigten bakteriellen Lysats auf die ausgeglichene Säule auf. Lass ihn durch die Schwerkraft hindurchströmen und verwirf den Fluss hindurch.

Anschließend wird die Säule gewaschen, indem man zwei aufeinanderfolgende 10-Milliliter-Volumina Bindungspuffer mit 20 millimolaren Imidazol in PBS aufträgt. Eliutieren Sie die gebundenen Nanokörper, indem Sie zwei Milliliter Elutionspuffer mit 500 millimolaren Imidazol in PBS in eine zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhre auftragen. Gleiche eine Entsalzungssäule in einem 50-Milliliter-Röhrenadapter aus, indem du fünfmal mit fünf Millilitern PBS spülst.

Lass den Puffer vollständig in das gepackte Harz eindringen und entsorge dann den Durchfluss. Nach der letzten Spülung zentrifugieren Sie die Säule bei 1000 x g für zwei Minuten. Nun bewege die Säule mit ihrem Adapter auf ein neues 50-Milliliter-Sammelrohr, nachdem du den Durchfluss entsorgt hast.

Laden Sie zwei Milliliter des elutierten funktionalisierten Nano auf die vorausgeglichene Entsalzungssäule. Anschließend wird erneut bei 1000 x g für zwei Minuten zentrifugiert, um das Eluat zu sammeln, bevor die VHH-mCherry-Expression und Reinheit validiert werden. Starten Sie die Software des automatisierten Live-Cell-Bildgebungssystems.

Übertragen Sie die Ibidi-Mikroskopiekammer auf die Mikroskopstufe. Richte zwei Bildgebungskanäle mit Anregungs- und Emissionsfiltern für EGFP und mCherry ein. Wählen Sie eine kurze Belichtungszeit und geringe Beleuchtungsintensität, um Fotobleichen zu vermeiden.

Halte die Einstellungen für alle Experimente konstant. Die Einstellungen können je nach Reporter unterschiedlich sein. Für jede Bedingung speichert man die Koordinaten von 10 verschiedenen Sichtfeldern mit drei bis vier Zellen in einer Punktliste.

Anschließend nimmt er eine einzelne Aufnahme jeder Position in der Punktliste auf, um als Referenzbild zu dienen, bevor VHH-mCherry hinzugefügt wird. Um die Endozytose einzuleiten, geben Sie vorsichtig 350 Mikroliter vorgewärmte VHH-mCherry-Lösung zu jedem Brunnen, wobei die Störung der Monoschicht minimiert wird. Dann machen Sie mit der Bildaufnahme weiter.

Führen Sie eine Zeitrafferaufnahme für 100 Bilder im 32. Intervall durch, wobei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid erhalten bleiben. Um die endozytische Aufnahme von VHH-mCherry zu analysieren, laden Sie die Zeitrafferbildsets in die Bildanalyse-Software. Segmentierungs- und Tracking-Tools anwenden, um internalisierte Fluoreszenz über die Zeit über verschiedene Interessensgebiete hinweg zu quantifizieren.

Alle funktionalisierten Nanowe-Varianten wurden auf hohe Erträge und Reinheit gereinigt, wobei nur VHH-mCherry eine geringe proteolytische Degradierung aufwies. Die Abbauprodukte von VHH-mCherry wurden als einzelne VHH-mCherry-Domänen mittels epitope-spezifischer Immunblot-Detektion bestätigt. In Abwesenheit von BirA wurde VHH-mCherry mit etwa 20 Milligramm pro Präparat gewonnen.

Und die Biotinylierung wurde durch den Pulldown von Nanoin-BSA-Mischungen mit Streptavidin-Agarose bestätigt. EGFP-markierte Fusionsproteine, die in HeLa-Zellen exprimiert wurden, zeigten subzelluläre Lokalisierungsmuster, die mit ihren endogenen Gegenstücken übereinstimmen, einschließlich perinuklearer Lokalisierung von EGFP-CDMPR und EGFP-CIMPR. Exklusive perinukleare Lokalisierung von EGFP-TGN46 und periphere Lokalisierung von TfR-EGFP.

VHH-mCherry ermöglichte die Visualisierung des endozytischen Transports von EGFP-CDMPR in lebenden Zellen, was eine zunehmende Kolokalisierung über 60 Minuten zeigte. Die Aufnahme von VHH-mCherry in die EGFP-CDMPR-exprimierenden Zellen erreichte nach etwa 43 Minuten ein Plateau mit einer Halbwertszeit von neun Minuten. In TfR-EGFP-exprimierenden Zellen akkumulierte sich VHH-mCherry schnell interzellulär, mit einer Halbwertszeit von vier Minuten und einer Sättigung nach 20 Minuten.

Wir haben ein vielseitiges, nanokörperbasiertes Toolkit entwickelt, um den Transport jedes transmembranären Proteins von der Zelloberfläche zu analysieren. Wir verwenden fluoreszierende Nanokörper, um Oberflächen-Cargo-Proteine zu markieren, und untersuchen dann ihren endozytischen Transport mittels lebender Zellmikroskopie. Mit unserem nanokörperbasierten Live-Cell-Imaging-Ansatz wollen wir Wege aufdecken, die den Frachttransport von der Oberfläche zum trans-Golgi-Netzwerk antreiben.