Name: Lebendzell-Bildgebung des endozytären Transports mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Live-Zell-Bildgebung des endozytären Transports mit funktionalisierten Nanobodies in HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung von Proteintrafficking in Echtzeit.

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<table><tbody><tr><td>Anti-GFP-Antikörper&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>Das Produkt wird von Sigma-Aldrich vertrieben, aber von Roche hergestellt</td></tr><tr><td>100-mm-Zellkulturschalen</td><td>TPP</td><td>TPP93100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Aktin-Antikörper</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-Antikörper</td><td>Aus dem Labor</td><td>hergestellt aus 12CA5 Hybridom</td><td></td></tr><tr><td>Anti-His6-Antikörper</td><td>Bethyl Laboratories&nbsp;</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-T7-Antikörper&nbsp;</td><td>Bethyl Laboratories&nbsp;</td><td>A190-117A</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent&nbsp;E. coli</td><td>SCHNABEL</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloriddihydrat</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>gelöst in sterilem Wasser, Bestand ist 1 M</td></tr><tr><td>Carbenicillin-Dinatriumsalz</td><td>Anwendung</td><td>A1491</td><td>gelöst in sterilem Wasser, Streu 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Brillantes Blau)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>gelöst in steriler 500 mM NaH2PO4 oder DMSO</td></tr><tr><td>Einweg-PD10-Entsalzsäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX-I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Blutzucker, kein Glutamin, kein Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Anwendung</td><td>A3778</td><td>gelöst in sterilem Wasser</td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) ohne Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S, PES, Porengr&ouml; &szlig; e: 0.45 & Mikro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfektionsreagenz</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Überdeckfolien (Nr. 1,5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Sein Puffer-Set</td><td>Cytvia</td><td>11003400</td><td></td></tr><tr><td>Seine GraviTrap-Säulen</td><td>Cytvia</td><td>11003399</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Slide 4 gut, ibiTreat</td><td>80426-IBI</td><td>Ibidi</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Anwendung</td><td>A1008</td><td>gelöst in sterilem Wasser, Bestand ist 1 M</td></tr><tr><td>Kanamycin-Sulfat</td><td>Anwendung</td><td>A1493</td><td>gelöst in sterilem Wasser, Streu 100 mg/mL</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Anwendung</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>Das Produkt wird von Sigma-Aldrich vertrieben, aber von Roche hergestellt</td></tr><tr><td>Magnesiumchloridhexahydrat</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>gelöst in sterilem Wasser, Bestand ist 1 M</td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX-Gels, 4-20 %, 15-Well</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Modifizierte HeLa Kyoto</td><td>Aus dem Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB5-alpha Competent&nbsp;E. coli</td><td>SCHNABEL</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 Vorbereitungen</td><td>Macherey-Nagel&nbsp;</td><td>740412.1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Bioconcept&nbsp;</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Anwendung</td><td>A0999.0025</td><td>gelöst in 40 % DMSO, 60 % Isopropanol, Stock in 500 mM</td></tr><tr><td>Phoenix-Amphozelllinie</td><td>Nolan-Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybren (Hexadimethrinbromid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-PR-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>gelöst in sterilem Wasser, Schaft 5 M</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Pack, Mini</td><td>Bio-Rad</td><td>1704158</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Anwendung</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt &nbsp;</td><td>Anwendung</td><td>A1552</td><td></td></tr></tbody></table>

lebendzell-bildgebung des endozytären transports mit funktionalisierten nanobodies in kultivierten zellen

Live-cell Imaging of Endocytic Transport using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Lebendzell-Bildgebung des endozytären Transports mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen

Endocytosis of receptors and other transmembrane proteins from the cell surface to endosomes and beyond is critical for homeostasis, physiology, and ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Live Cell Imaging ist von besonderem Nutzen bei der Untersuchung der Dynamik von Organellen Menschenhandel. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Live-Darstellung von Dense-Core-Vesikel in kultivierten Neuronen mit Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll ist flexibel und kann an image anderen Organellen wie Mitochondrien angepasst werden, Endosomen und Peroxisomen.

Live-Imaging von Dense-Core-Vesikel in Primary hippokampalen Neuronen

Quelle: Zhang, Y., et al. Anwendung von fluoreszierenden Nanopartikeln zur Untersuchung des Umbaus des endolysosomalen Systems durch intrazelluläre Bakterien. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt die Verwendung von fluoreszierenden Nanopartikeln zur Visualisierung des endolysosomalen Umbaus in menschlichen Epithelzellen, die von intrazellulären Bakterien infiziert sind. Nach der bakteriellen Invasion manipulieren die Erreger das Zytoskelett des Wirts und das endolysosomale System und bilden...

Nanopartikel-vermittelte Visualisierung des endo-lysosomalen Umbaus in bakteriell infizierten Zellen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Untersuchung der Aufnahme und des retrograden Transports von funktionalisierten Nanobodies, um ihre intrazellulären Transportwege zu verstehen. Durch die Einführung von radioaktiv markiertem Sulfat und den Einsatz von Isolierungs- und Nachweistechniken ermöglicht diese Methode die Untersuchung der endozytären Aufnahme und der Ankunft von Frachtproteinen im trans-Golgi-Netzwerk.

Überwachung der Ankunft von GFP-markierten Oberflächenproteinen im trans-Golgi-Netzwerk mit funktionalisierten Nanobodies

Dieses Video zeigt, wie neuronale Vesikel mit spezifischen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um ihre Bewegung zu visualisieren. Zuerst wird ein Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Transfektionsmittel inkubiert und dann in eine Kultur von Neuronen eingeführt. Anschließend werden Bilder der Neuronen aufgenommen und analysiert, um die Bewegung der Vesikel zu verfolgen.

Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Live Cell Imaging ist ein mächtiges Werkzeug, um dynamische Prozesse zu visualisieren. Die Prüfung der fixen Zellen bietet nur statische Bilder, was zu Fehlinterpretationen und Verwirrung über den Prozess führen kann. Dieses Werk stellt eine Methode zur Aufnahme, Wirkstofffreisetzung und intrazelluläre Lokalisation der liposomalen Nanopartikel in lebenden Zellen zu studieren.

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Retrograder Transport von Proteinen von der Zelloberfläche an die Golgi unbedingt Membran Homöostase. Hier beschreiben wir eine Methode um biochemisch Zelle Oberfläche-Golgi Transport von rekombinanten Proteinen mit funktionalisierten Nanobodies in HeLa-Zellen zu analysieren.

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Erfahren Sie die Live-Zell-Bildgebung des endozytären Transports mit funktionalisierten Nanobodies in HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung von Proteintrafficking in Echtzeit.

Lebendzell-Bildgebung des endozytären Transports mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen

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