Name: Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Erfahren Sie zwei Zelllysemethoden zur Ubiquitinierungsdetektion in Säugetierzellen mit HEK293T-Zellen und SMAD2/SMURF2 als Modell. Diese Techniken unterstützen Forscher bei der Auswahl optimaler Methoden für Proteinregulationsstudien.

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<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinase+OTUD1+stabilizes+NRF2+to+alleviate+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinase OTUD1 stabilizes NRF2 to alleviate hepatic ischemia/reperfusion injury.</a> Redox Biol. 75, 103287(2024).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikroröhre</td><td>Servicebio</td><td>EP-150-M</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-behandelte kultivierte Schale</td><td>Servicebio</td><td>CCD-100</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Scheibe</td><td>Servicebio</td><td>CCP-6H</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>20543-1-AP</td><td>Verdünnung verwendet 1:200 für IP 1:10000 für WB</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH-Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>MA5-15738</td><td>Verdünnung verwendet 1:10000</td></tr><tr><td>Anti-HA-Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>51064-2-AP</td><td>Verdünnung verwendet 1:10000</td></tr><tr><td>Anti-IgG-Antikörper</td><td>CST</td><td>#3900</td><td>Verdünnung verwendet 1:200 für IP</td></tr><tr><td>Anti-MYC-Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>60003-2-Ig</td><td>Verdünnung verwendet 1:10000</td></tr><tr><td>Anti-SMAD2-Antikörper</td><td>CST</td><td>#5339</td><td>Verdünnung verwendet 1:200 für IP 1:2000 für WB</td></tr><tr><td>Bromophenolblau</td><td>Servicebio</td><td>GC307006-5g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (pH = 8,0)</td><td>Servicebio</td><td>G1207-1L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ABW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>Heiz-/Kühl-Trockenbad</td><td>Guocheng</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Glukosehoch-DMEM</td><td>Servicebio</td><td>G4515-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HRP-konjugierte Ziegen-Anti-Maus IgG Light Chain&nbsp;</td><td>Abklonal</td><td>AS062</td><td>Verdünnung verwendet 1:5000</td></tr><tr><td>HRP-konjugierte Maus-Anti-Rabbit IgG Light Chain&nbsp;</td><td>Abklonal</td><td>AS061</td><td>Verdünnung verwendet 1:10000</td></tr><tr><td>Lipo8000</td><td>Beyotime</td><td>C0533</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Aladdin</td><td>M421264</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Labgic</td><td>CF1524R</td><td></td></tr><tr><td>NaCl-Pulver</td><td>Servicebio</td><td>GC102004</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500ML</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-FLAG-SMAD2</td><td></td><td></td><td>Für die Säugetierexpression</td></tr><tr><td>pCMV-HA-Ub</td><td></td><td></td><td>Für die Säugetierexpression</td></tr><tr><td>pCMV-MYC</td><td></td><td></td><td>Für die Säugetierexpression</td></tr><tr><td>pCMV-MYC-SMURF2</td><td></td><td></td><td>Für die Säugetierexpression</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Servicebio</td><td>G4003-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail ohne EDTA</td><td>TargetMol</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G Agaroseperlen</td><td>Beyotime</td><td>P2017</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Vayzme</td><td>E801</td><td></td></tr><tr><td>SDS-Pulver</td><td>Solarbio</td><td>S8010-500g</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE-Sysytem</td><td>Aervicebio</td><td>BVE4-BVT4</td><td></td></tr><tr><td>Sonics</td><td>Uibra-Zelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl-Pulver</td><td>Biotopped</td><td>HST-0372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Servicebio</td><td>GC204003-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Servicebio</td><td>G4021-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mixer</td><td>Freundlicherweise gespendet von Vayzme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercapptoethanol</td><td>Aladdin</td><td>M301573</td><td></td></tr></tbody></table>

vergleichende strategien zur nachweisung der uquitination in säugetierzelllysaten unter verwendung von smad2/smurf2 als modell

Comparative Strategies for Ubiquitination Detection in Mammalian Cell Lysates Using SMAD2/SMURF2 as a Model

Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

Ubiquitination, a post-translational modification, is a critical regulator of intracellular protein function. Ubiquitination modulates protein functions ...

comparative-strategies-for-ubiquitination-detection-mammalian-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen...

Detektion von Protein Ubiquitination

Dieses Video demonstriert die in vitro Methode zur SUMOylierung von Substratproteinen unter Verwendung einer sequentiellen Enzymkaskade. Weiterhin wird der SUMOylierte Status des Proteins mit Hilfe der Elektrophorese- und Immunblotting-Technik identifiziert.

SUMOylation Assay: Eine in vitro Technik zum Nachweis des SUMOylierungsstatus von Substratproteinen durch Immunoblotting

Auf den aktuellen Protokollinformationen ein Verfahren zur Messung der Aktivität der funktionell homolog Deubiquitinierungsenzyme. Specialized-Sonden, die das Enzym kovalent modifizieren und lassen für die Erkennung. Dieses Verfahren hält das Potenzial, neue therapeutische Targets zu identifizieren.

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase.  Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Reinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen aus Zellen gereinigt.

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Erfahren Sie zwei Zelllysemethoden zur Ubiquitinierungsdetektion in Säugetierzellen mit HEK293T-Zellen und SMAD2/SMURF2 als Modell. Diese Techniken unterstützen Forscher bei der Auswahl optimaler Methoden für Proteinregulationsstudien.

Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

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