Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

Ubiquitination, gesteuert durch die enzymatische Kaskade E eins, E zwei, E drei, ist ein wichtiger Regulator der Proteinfunktion. Die strukturelle Flexibilität von Ubiquitin ermöglicht es, verschiedene Ketten über verschiedene Lysin- oder Met-1-Verbindungen zu bilden, wobei jede Topologie ein unterschiedliches Ergebnis bestimmt: K 48 für den Abbau, K 63 für Signalübertragung und Reparatur und Met für die angeborene Immunität. Diese Studie unterscheidet und vergleicht zwei verschiedene Zelllysemethoden, um die Anwendungswerte in den Säugetierzellen anhand von Schlumpf zwei, SMAD zwei als Modell zu messen, was Forschern dabei hilft, geeignetere Methoden zur Nachweisung des Ubiquitinationsniveaus von Substratproteinen auszuwählen.

Halten Sie HEK zwei 93 T-Zellen in hochglukosehaltigem DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und einem Prozent PS. Samenzellen in sechs Brunnenplatten mit 500.000 Zellen pro Bohrloch. Bereite Transfektionsmischungen so vor, dass sie 10 % des gesamten Kulturwerts repräsentieren, und nutze SMAD-2-Ubiquitination als experimentelles Modell. Kombinieren Sie verschiedene Plasmide in 100 Mikrolitern serumfreiem DMEM.

In einem separaten Röhrchen wird Transfektionsreagenz verdünnt. Während die Reagenzmischung in die Plasmidlösung abfällt, inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur und verteilen Sie es gleichmäßig auf die Zellen. Ersetze das Transfektionsmedium nach sechs bis Stunden durch zwei Mikroliter frisches, vollständiges DMEM pro Brunnen.

Behandle die Zellen mit fünf Nanometer MG eins drei zwei für 12 Stunden vor der Entnahme. Mittel aspirieren und jede gut mit einem Milliliter vorgekühltem PBS abwaschen. Entfernen Sie PBS komplett.

Übertragen Sie die Suspension in ein Ein-Komma-Fünf-Rohr und legen Sie es auf Eis. Zentrifugiere bei dreihundertachtzig XG für fünf Minuten bei vier Grad. Entferne das Überdachungsmittel und behalte das Pellet.

Übertragen Sie 50 Mikroliter Protein-AG-Agaroseperlen pro Probe in ein neues Rohr. Wasche Perlen dreimal mit einem Milliliter Lysis-Puffer. Entferne den Restpuffer, ohne das Pellet zu stören.

Bei 100 Mikrolitern Arbeitslösung und fünf Mikrolitern Antikörper. Gib 500 Mikroliter vorgekühlte Arbeitslösung zum Pellet. 30 Minuten auf Eis inkubieren.

Sonikate bei zwei W mit vier Sekunden eingeschaltet, vier Sekunden ausgeschalteten Zyklen für fünf Wiederholungen. Proben für den Rest der Brützeit wieder ins Eis bringen. Gib 40 Mikroliter Arbeitslösung zum Pellet.

Füge fünf Mikroliter über 10 % SDS hinzu, während du kontinuierlich mischst. Kurz vortexen und bei 95 Grad erhitzen, bis die Suspension transparent und vollständig verflüssigt ist. Invertiere intermittierend, um eine gleichmäßige Denaturierung sicherzustellen.

Fügen Sie eine 450-Mikroliter-Arbeitslösung hinzu. Sonikate bei zwei W und nutze vier Sekunden auf vier Sekunden Pause für fünf Wiederholungen. Zentrifuge Lysate für 15 Minuten bei vier Grad.

Reservieren Sie 60 Mikroliter Lysat und fügen Sie 15 Mikroliter von fünf Multi-Loading-Puffern hinzu. Erhitze 15 Minuten bei 37 Grad Celsius und kenne es als Eingabe. Fügen Sie dem verbleibenden Lysat 100 Mikroliter antikörpergekoppelte Perlen hinzu.

Inkubieren Sie bei vier Grad für acht bis zwölf Stunden mit Rotation. Zentrifugiere mit 100 XG für eine Minute bei vier Grad und entsorge Supernatant. Füge 75 Mikroliter eines Multi-SDS-Ladepuffers hinzu und halte 15 Minuten lang 95 Grad, um Proteine zu elutieren, als IP zu kennzeichnen. Erkennen Sie ubiquinierte Proteine mittels Western Blot.

HE K, zwei 93-T-Zellen, wurden transfektiert und mit MG eins 32 stimuliert. Die Zellen wurden in fünf Gruppen entsprechend unterschiedlichen Behandlungsmethoden unterteilt, und die Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen sind wie folgt: Ohne Flagge SMAD zwei Spuren eins, ohne MG eins drei zwei Spuren zwei, ohne FLAG-Antikörper hinzugefügt in Beads Spur drei, mit MYC-SMURF zwei Spur fünf. Alle Zellen wurden mit der Eisbadmethode lysiert.

Bahn eins diente als Kontrolle zur Überprüfung der erfolgreichen Überexpression des SMAD-Zwei-Plasmids. Bahn zwei diente als Kontroll, um die inhibitorische Wirkung von MG eins drei zwei auf den Abbau ubiquitinierter Proteine nachzuweisen. Bahn drei diente als Kontrolle, um zu bestätigen, dass die unspezifische Bindung vollständig beseitigt wurde.

Bahn fünf wurde verwendet, um den fördernden Effekt von SMURF zwei auf die Verbreitung von SMAD zwei zu untersuchen. Der Graustufenwert von HA in Bahn fünf war höher als in Bahn vier, was zeigte, dass SMURF zwei das Ubiquitinationsniveau von SMAD zwei erhöhte. Als wir mit der Wärmebehandlungsmethode Lysezellen untersuchten, erzielten wir ähnliche Ergebnisse wie mit der Eisbadmethode, jedoch konnte bei der Wärmebehandlung die Expression von SMURF 2 in den IP FLAG-Ergebnissen nicht nachweisbar sein.

Wir zeigten außerdem, dass die Wärmebehandlungsmethode auch für den Nachweis der Ubiquitination endogener Proteine geeignet ist. Wir vergleichen außerdem die Effizienz der beiden Methoden bei der Erkennung von Ubiquitinationsniveaus, sei es in den Eingabe- oder IP-Flag-Ergebnissen, und stellten fest, dass der Graustufenwert von HA in der Gruppe mit der Wärmebehandlungsmethode höher war als bei der Eisbadmethode. Um die Signalerkennung zu verbessern, verwendeten wir eine plasmidbasierte Überexpression kombiniert mit MG 13 2-Behandlung während der Zellernte, um den Abbau ubiquitinierter Proteine zu verhindern.

Die Lysatpräparation erfordert eine sorgfältige Modulation der Na-Cl-Konzentration, da hoher Salzgehalt schwache Wechselwirkungen stört, während niedriges Salzgehalt die unspezifische Aggregation erhöht. Allerdings können niedrige Konzentrationen zu übermäßigem Hintergrund durch unspezifische Aggregate führen. Verbesserte Proteinanreicherungs-Erholungsantikörper gegen Perlen bei vier Grad gewährleisten eine effizientere Aufnahme von Zielproteinen und reduzieren unspezifische Bindungen.

Bei der Wärmebehandlung ist es entscheidend, sicherzustellen, dass die SDS-Konzentration unter einem Prozent bleibt; SDS kann Antikörper aus den Perlen entfernen. Diese Studie legt verschiedene Lysemethoden auf und vergleicht sie, um die Ubiquitinierungswerte in Säugetierzellen unter Verwendung von SMURF zwei SMAD zwei als Modell zu messen, was Forschern hilft, geeignetere Methoden zur Detektion der Ubiquitinierungswerte von Substratproteinen auszuwählen.