Name: Effiziente und schnelle Erzeugung von CAR-T- und zytokininduzierten Killerzellen in GMP-skalierbaren Geräten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Expansion von CAR-T- und CIK-Zellen in G-Rex-Geräten für die adoptive Zelltherapie. Diese skalierbare Methode ermöglicht robustes Zellwachstum mit minimaler Benutzerintervention für klinische Anwendungen.

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<ol><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">NK cells for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).</li>
<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+cytokine-induced+killer+cells+overcome+CAR-T+cell+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits.</a> Front Immunol. 14, 1229540(2023).</li>
<li>Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((30+years+of+CIK+cell+therapy%3A+Recapitulating+the+key+breakthroughs+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective.</a> J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).</li>
<li>Bayatipoor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NKT+cells+in+cancer+immunotherapy-from+bench+to+bed%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed.</a> Med Oncol. 40, 29(2022).</li>
<li>Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+by+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy by γδ T cells.</a> Science. 386, 6717(2024).</li>
<li>Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+melanoma%3A+A+viable+treatment+option%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option.</a> J Immunother Cancer. 6, 102(2018).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+The+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+world+of+TCR-T+cell+trials+against+cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review.</a> Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).</li>
<li>Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).</li>
<li>Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors%3A+The+paradigm+of+cytokine-induced+killer+%28CIK%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).</li>
<li>Palmerini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-free+protocol+for+the+ex+vivo+expansion+of+cytokine-induced+killer+cells+using+gas-permeable+static+culture+flasks%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks.</a> Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).</li>
<li>Pietà, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+therapeutic+strategy+for+B-cell+malignancies+that+combines+obinutuzumab+and+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells.</a> J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).</li>
<li>Pievani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+capability+of+CD3%2BCD56%2B+CIK+cells%2C+a+T-cell+subset+that+acquires+NK+function+and+retains+TCR-mediated+specific+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity.</a> Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).</li>
<li>Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+cytokine-induced+killer+cell+activity+by+CD16+engagement+with+clinical-grade+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies.</a> OncoImmunology. 5, e1199311(2016).</li>
<li>Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+and+unmodified+cellular+approaches+to+enhance+graft+versus+leukemia+effect%2C+without+increasing+graft+versus+host+disease%3A+The+use+of+allogeneic+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells.</a> Front Immunol. 15, 1459175(2024).</li>
<li>Rotte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+correlation+for+CAR-T+cells%3A+A+systematic+review+of+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies.</a> J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).</li>
<li>Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+update+of+the+international+registry+on+cytokine-induced+killer+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy.</a> J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).</li>
<li>Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+expansion+in+bioreactors%3A+Upgrading+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy.</a> J Biol Eng. 15, 13(2021).</li>
<li>Smith, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+expansion+in+a+Xuri+Cell+Expansion+System+W25%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25.</a> Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).</li>
<li>Ludwig, J., Hirschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+process+optimization+for+large-scale+CAR+T+expansion+using+the+G-Rex+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform.</a> Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).</li>
<li>Vera, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J Immunother. 33, 305-315 (2010).</li>
<li>Bajgain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+%26%2334%3BM%26%2334%3B+series%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex &#34;M&#34; series.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).</li>
<li>Talleur, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+CD27-depleted+cells+in+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy.</a> Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).</li>
<li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+HER2%2Fneu-specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr-51+release+assay+to+the+xCELLigence+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system.</a> J Vis Exp. (66), e3683(2012).</li>
<li>Eberhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+serum-free+media+on+the+expansion+and+functionality+of+CD19.CAR+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells.</a> Int J Mol Med. 52, 58(2023).</li>
<li>Cadiñanos-Garai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+temporal+mapping+of+CAR+T+cells+reveals+phenotypic+and+functional+remodeling+during+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing.</a> Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).</li>
<li>Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+process+development+of+NK+and+CAR-NK+expansion+in+a+closed+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor.</a> Front Immunol. 15, 1412378(2024).</li>
<li>Noldner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lung+cancer+tumor-infiltrating+lymphocyte+%28TIL%29+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing.</a> Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).</li>
<li>Bandeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+lentiviral+vectors%3A+Releasing+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).</li>
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Die adoptive Zelltherapie (ACT) ist zu einer wichtigen Säule fortschrittlicher Therapien zur Krebsbehandlung geworden. Dieser Ansatz basiert auf der Verabreichung ex-vivo erweiterter zellulärer Produkte, um eine antitumorwirksameWirksamkeit zu erreichen. Bis heute wurden viele Zelltypen im ACT eingesetzt, von antigen-aspezifischen Ansätzen, z. B. natürlicher Killer (NK)2, zytokininduzierter Killer (CIK)3,4, natürlicher Killer T (NKT)5 oder γδ T-Zellen6, bis hin zu hochspezifischen und personalisierten Methoden wie tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs)7 und konstruierten zellbasierten Therapien, z. B. chimerischer Antigenrezeptor (CAR)1, 8 und T-Zell-Rezeptorzellen (TCR) 9,10.
CAR-T-Zellen sind genetisch veränderte T-Zellen, die durch ex vivo virale Transduktion erzeugt werden, um einen synthetischen Immunrezeptor zu exprimieren, der ein spezifisches molekulares Ziel erkennt. Die CAR-Struktur besteht aus einem antigen-spezifischen einkettigen Fragment (scFv)-Antikörper, kombiniert mit intrazellulären Signaldomänen, einschließlich der TCRζ-Kette und kostimulatorischen Molekülen. Bei Antigen-Engagement liefert die intrazelluläre Domäne Aktivierungssignale, die die Proliferation von T-Zellen und die Antitumoraktivitätfördern 11.
CIK-Zellen sind eine heterogene Population aktiverter T-Lymphozyten, die während der ex-vivo-Expansion von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) oder Nabelschnurblut (UCB)12 die Expression von CD56 aufnehmen. Diese Expansion beinhaltet eine Stimulation mit Interferon-γ (IFN-γ), anti-CD3 monoklonalem Antikörper und Interleukin-2 (IL-2), gefolgt von einer 14-tägigen Kultur in IL-2. CIK-Zellen ähneln funktional sowohl NK- als auch T-Zellen und üben Antitumoraktivität sowohl durch Major Histocompatibility Complex (MHC)-unabhängige als auch abhängige Mechanismenaus 13,14,15,16. Diese Eigenschaften ermöglichen den Einsatz von CIK-Zellen sowohl in allogenen als auch in autologen therapeutischen Umgebungen mit minimalem Graft-versus-Host-Erkrankungsrisiko (GvHD)17.
In der klinischen Praxis erfordern sowohl CAR-T- als auch CIK-Zelltherapien die Verabreichung großer Zellmengen. CAR-T-Zellen werden mit 50–200 Millionen Dosen pro18-jähriger Patientin infundiert. Ähnlich werden CIK-Zellen typischerweise in Dosen von bis zu 10 Milliarden Zellen pro Infusion verabreicht, wobei Patienten je nach Behandlungsprotokoll19 oft mehrere Infusionen erhalten. Traditionelle Zellkulturmethoden mit Kolben oder Platten sind ineffizient, zeitaufwendig und erfordern häufiges Durchlaufen, was die großflächige Expansion unmöglich macht und das Kontaminationsrisiko erhöht. Automatisierte oder halbautomatisierte Systeme, die Beutelkulturen oder Bioreaktoren verwenden, ermöglichen eine großflächige Ausdehnung, haben jedoch Einschränkungen, z. B. Scherspannung oder die Notwendigkeit von Dichteanpassungen und häufiger Mediumperfusion20,21 sowie die Handhabung einer Charge auf einmal, was sowohl in akademischen als auch im industriellen Kontext zu hohen Kosten führt. In dieser herausfordernden Situation stellt das gasdurchlässige Schnellexpansionsgerät (G-Rex) eine Alternative dar, ein statisches Kulturverfahren mit einer Siliziummembran am Boden des Bohrlochs, die einen effizienten Sauerstoffaustausch und eine erhöhte Höhe der Behälter gewährleistet und so eine Kapazität mit großem Volumen ermöglicht. Daher unterstützt das System das Zellwachstum ohne Mittelersatz oder Dichteanpassung22,23. G-Rex-M-Systeme haben eine Skalierbarkeit bis zu 5000 mL nachgewiesen und sind mit automatisierten Erntesystemen kompatibel, wodurch eine kontaminationsfreie und geschlossene Kulturplattform bereitgestellt wird, die leicht von akademischen in klinische Einrichtungen für die Entwicklung fortschrittlicher Therapiearzneimittel (ATMPs)24 übertragbar ist.
In dem beschriebenen Verfahren nutzten wir die Vorteile und Eigenschaften von G-Rex-Geräten, um das Expansionsprotokoll sowohl der CAR-T- als auch der CIK-Zellen zu optimieren. Wir zeigten, dass beide Zelltypen effizient erweitert und skaliert werden können, wobei ein konsistenter Phänotyp und ein funktionales Profil über verschiedene Kultursysteme erhalten bleiben. Eine schematische Übersicht des Expansionsprotokolls für sowohl CIK- als auch CAR-T-Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Abbildung 1: Überblick über CAR-T- und CIK-Zellexpansionsprotokolle mit G-24- oder G-6M-Kulturgeräten. CAR-T- und CIK-Zellen werden ab Tag 0 aus isolierten PBMCs erweitert. Zur Erweiterung der CAR-T-Zellen werden PBMCs am ersten Tag mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern stimuliert, am zweiten Tag genetisch verändert und anschließend alle 3-4 Tage mit hIL-7- und hIL-15-Supplementierung kultiviert, mit der finalen Ernte für funktionelle Assays am Tag 9. Im G-6M-Format ist die Zytokin-Supplementierung auf Tag 2 beschränkt, ohne zusätzliche Zytokinfütterung während der Kulturperiode. Zur Erweiterung der CIK-Zellen werden PBMCs am ersten Tag mit rhIFN-γ und am zweiten Tag mit Anti-CD3-Antikörpern und rhIL-2 stimuliert, die dann alle 3–4 Tage verabreicht werden. Bei G-24 ist ein Mediumwechsel gleichzeitig mit dem Zytokinpräparat erforderlich. CIK-Zellen werden am 14. Tag für nachgelagerte funktionelle Assays entnommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD28 Antikörper, anti-menschlich</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-375</td><td>Klon 15E8</td></tr><tr><td>CD3-Antikörper, anti-menschlich</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-387</td><td>Klon OKT3</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>740147</td><td>Klon UCHT1</td></tr><tr><td>CD314 APC (NKG2D)</td><td>Biolegende</td><td>320808</td><td>Klon 1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>563875</td><td>Klon SK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>563429</td><td>Klon HI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>Biolegende</td><td>318306</td><td>Klon HCD56</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555543</td><td>Klon FREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BD Biosciences</td><td>562428</td><td>Klon RPA-T8</td></tr><tr><td>CellTrace Violett Zellproliferations-Kit</td><td>ThermoFisher wissenschaftlich</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxidid (DMSO)</td><td>ThermoFisher wissenschaftlich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>E-Kennzeichen 16</td><td>Agilent</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS), Wert</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain 780 (FVS780)</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 24 Brunnenplatten&nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 6M Bohrlochplatten&nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Pufferlösung</td><td>Lonza</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>Sein Antikörper</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches Albumin 20 %</td><td>CSL Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humanes IL-15 Rekombinantes Protein</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Humanes rekombinantes IL-7-Protein</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL-Technologien</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Brustkrebszelllinie&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Physiologische Lösung (0,9 % Natriumchlorid)</td><td>Monico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protaminsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Burkitt-Lymphomzelllinie&nbsp;</td></tr><tr><td>Rekombinantes menschliches IFN-gamma</td><td>R& D-Systeme</td><td>285-IF-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant IL-2 (Proleukin)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-His</td><td>Invitrogen</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Gedenkinstitut 1640 (RPMI-1640)</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>Stabiles L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-Blau-Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Echtzeit-Zellanalyse</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Serumfreies hämatopoietisches Zellmedium</td><td>Lonza</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente und schnelle erzeugung von car-t- und zytokininduzierten killerzellen in gmp-skalierbaren geräten

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

Das hier beschriebene Protokoll bietet einen effizienten und robusten Arbeitsablauf für die ex vivo Expansion und Entwicklung von Effektorzellen aus isolierten PBMCs, nämlich CAR-T- und CIK-Zellen. Diese Methode erfordert nur minimale Zellmanipulation und nutzt die Gasaustauschkapazität von G-Rex-Geräten, wodurch sie eine überlegene Nährstoffverfügbarkeit und Sauerstoffversorgung im Vergleich zu herkömmlichen statischen Kultursystemenbietet 23,24. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls ist seine inhärente Skalierbarkeit von kleinen 24-Well-Geräten (G-24), geeignet für präklinische Studien, bis hin zu größeren 6M-Geräten (G-6M), die mit translationalen oder klinischen Fertigungsanforderungen kompatibel sind und ohne Änderungen am Protokoll außer proportionaler Skalierung erforderlich sind.
Mit diesem Protokoll wurden sowohl CAR-T- als auch CIK-Zellen erfolgreich parallel aus gesunden Spender-PBMCs in den Formaten G-24 und G-6M erweitert, wie in den Abschnitten 2-4 beschrieben. Am Ende der Kulturperiode zeigten beide Zelltypen eine hohe Faltenerweiterung und -lebensfähigkeit mit vergleichbarer Proliferation zwischen den beiden Geräteformaten (Abbildung 2, Ergänzende Tabelle 1, Ergänzende Tabelle 2), was die Reproduzierbarkeit des Protokolls über verschiedene Kulturskalen hinweg unterstreicht.
Um die Skalierbarkeit der Kulturgeräte zu validieren, wurden die Effektorzellen phenotypisch und funktional weiter charakterisiert. Für die CD19 CAR-T-Zellen quantifizierten wir die CAR-Expression und bewerteten die CD4+- und CD8+-Teilmengen, wobei wir eine Überwiegung von CD19 CAR+ CD8+ T-Zellen feststellten (Abbildung 3A-B, ergänzende Tabelle 1). Für CIK-Zellen bewerteten wir die Häufigkeit der T-Populationen (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) und CIK (CD3+CD56+) (Abbildung 3D) sowie die Expression des aktivierenden Rezeptors NKG2D (Abbildung 3E, ergänzende Tabelle 2). Darüber hinaus beobachteten wir insgesamt vergleichbare Phänotypen und Expression spezifischer Populationsmarker zwischen den G-24- und G-6M-Kulturformaten für sowohl CAR-T- als auch CIK-Zellen. Der Differenzierungsstatus sowohl der CD19 CAR-T- als auch der CIK-Zellprodukte wurde mittels CD62L- und CD45RA-Färbung analysiert (Abbildung 3C-F, Ergänzungstabelle 1, Ergänzende Tabelle 2), die ähnliche Gedächtnis- und Effektorphänotypen zwischen Zellen zeigte, die in G-24- und G-6M-Formaten kultiviert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Skalierung des Prozesses weder die phänotypische Integrität noch den Differenzierungsstatus der erweiterten Effektorzellpopulationen beeinträchtigt.
Schließlich haben wir zur Bewertung der funktionellen Potenz zielspezifische Zytotoxizitätstests eingesetzt. Sowohl CD19 CAR-T- als auch CIK-Zellen, die in einem der beiden Geräte expandierten, zeigten eine starke zytolytische Aktivität, was die Erhaltung funktioneller Eigenschaften über die gesamte Skala hinweg bestätigt (Abbildung 4). Insgesamt unterstützen diese Ergebnisse die Eignung der erweiterten Produkte für nachgelagerte Anwendungen in präklinischen Modellen und möglicherweise klinische Tests.
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Abbildung 2: Proliferation und Lebensfähigkeit von CD19 CAR-T- und CIK-Zellen. CAR-T-Zellen (n = 5) und CIK-Zellen (n = 6), die aus PBMCs in G-24- und G-6M-Platten expandiert wurden, wurden an Tag 9 bzw. Tag 14 der Expansion entnommen, um die Zellzählung durchzuführen und den (A-C)-Faltenzuwachs sowie den (B-D) Anteil lebensfähiger Zellen zu bewerten. Histogramme stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar, und Punkte zeigen einzelne Spender an (siehe Ergänzende Tabelle 1 und Ergänzende Tabelle 2 für einzelne Werte). Die Daten wurden mit einem zweiseitigen, mehrfachpaarigen t-Test (A-C) oder einem mehrseitigen Wilcoxon-Matched-Pairs-Rank-Test (B-D) analysiert, mit Holm-Sidak-Korrektur für mehrere Vergleiche (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3: Bewertung des Phänotyps von CD19 CAR-T- und CIK-Zellen, die in G-24- und G-6M-Geräten erweitert wurden. Die Expression von CAR-Molekülen auf CD19 CAR-T-Zellen (n = 5) wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert, um (A) die Transduktionseffizienz in den G-24- und G-6M-Expansionsprotokollen sowie die Expression von (B) CD4+/CD8+ und (C) naiven/Gedächtnissubpopulationen in der CD3+CAR+-Subgruppe zu bewerten. Der Phänotyp von Bulk-CIK-Zellen (n = 6) wurde mittels Flusszytometrie analysiert, um (D) den Prozentsatz von CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) und T (CD3+CD56-) sowie die Expression von (E) NKG2D und (F) naiver/Speicher-Subpopulation in der CD3+CD56+-Teilmenge (G-24 n=5, G-6M n=6) zu untersuchen. Naïve (CD45RA+CD62L+), Zentralspeicher (CM, CD45RA-CD62L+), Effektorspeicher (EM, CD45RA-CD62L-) und Effektorspeicher CD45RA-positiv (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogramme stellen die mittlere Expression ± SD dar, und Punkte zeigen einzelne Spender an (siehe Ergänzende Tabelle 1 und Ergänzende Tabelle 2 für einzelne Werte). Die Daten wurden mit einem zweiseitigen multiplen gepaarten t-Test (B-C-D-F) oder einem zweiseitigen Wilcoxon-Matched-Rank-Test (A-E) analysiert, mit Holm-Sidak-Korrektur für Mehrfachvergleiche (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4: Bewertung der Zytotoxizität von CD19 CAR-T und CIK-Zellen. (A) Die spezifische Lyse von CD19-CAR-T-Zellen (orange, n = 5) oder untransducierten (UTD) Zellen (grau, n = 5) gegen die Burkitt-Lymphom-Raji-Zelllinie (als Suspensionszelllinienmodell) wurde durch einen 6-Stunden-Durchflusszytometrie-basierten Killing-Test durchgeführt. Die Ergebnisse werden als mittlere spezifische Lyse ± SD dargestellt. (B) Die Zytotoxizität von CIK-Zellen, die entweder in G-24 (hellblau, n = 7) oder G-6M (dunkelblau, n=6) gegen die Brustkrebs-MCF-7-Zelllinie (als adhärentes Zelllinienmodell) kultiviert wurden, wurde alle 15 Minuten über 24 Stunden mit einem Echtzeit-Zellanalysator überwacht. Die Ergebnisse werden als mittlere spezifische Lyse ± SEM dargestellt. Die Daten wurden mit dem Mann-Whitney-Test analysiert, Holm-Sidak-Korrektur für Mehrfachvergleiche (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Gating-Strategie für Flowzytometrie-Analysen. Repräsentative Diagramme, die die Gating-Strategien für (A) die phänotypische Charakterisierung von CAR-T-Zellen und (B) CIK-Zellphänotypisierung sowie (C) fluoreszierende, farbstoffbasierte Zytotoxizitätstests veranschaulichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Wachstum, Lebensfähigkeit und Phänotyp von CD19 CAR-T-Zellkulturen von einzelnen Spendern. Gesamtzellanzahl, Faltenzunahme, Lebensfähigkeit und phänotypische Charakterisierung der CD19-CAR-T-Zellen, die am 9. Tag der Kultur in G-24- und G-6M-Geräten entnommen wurden, werden für jeden Spender gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Wachstum, Lebensfähigkeit und Phänotyp von CIK-Zellkulturen von einzelnen Spendern. Gesamtzellanzahl, Faltenzuwachs, Viabilität und phänotypische Charakterisierung der am Tag 14 der Kultur in G-24- und G-6M-Geräten entnommenen CIK-Zellen werden für jeden Spender gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Effiziente und schnelle Erzeugung von CAR-T- und zytokininduzierten Killerzellen in GMP-skalierbaren Geräten

Adoptive cell therapies (ACT) have progressed rapidly in recent years, playing a pivotal role in cancer immunotherapy and significantly influencing ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Eine schnelle, einfache und kostengünstige Protokoll für die Erzeugung von Spender-derived multivirus-spezifische CTLs (RCTL) zur Infusion einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger die Gefahr der Entwicklung CMV, Adv. oder EBV-Infektionen. Dieses Herstellungsverfahren ist GMP-konform und sollte die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie über spezialisierte Zentren zu gewährleisten.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Die lymphodepletiven und immunmodulatorischen Effekte von Chemotherapie und Bestrahlungsstandard können genutzt werden, um die Antitumorwirksamkeit der T-Zell-Immuntherapie zu verbessern. Wir skizzieren eine Methode zur Erzeugung von EGFRvIII-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen und deren Verabreichung im Rahmen der Glioblastom-Standardtherapie.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, pathogenspezifische T-Zellen in klinischer Qualität herzustellen, indem ein automatisiertes Zellanreicherungsgerät der zweiten Generation verwendet wird, das ein geschlossenes Zytokin-Capture-System enthält und kein spezielles Personal oder die Verwendung einer GMP-Einrichtung erfordert. Die erzeugten pp65-spezifischen T-Zellen des Cytomegalievirus können direkt an Patienten verabreicht werden.

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Bearbeitung von CAR-T-Zellen über ein CRISPR/Cas9-System vor.

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von antigenspezifischen CD8-T-Zellen und deren Ausdehnung in vitro mit dem Ziel, eine hohe Anzahl funktioneller T-Zellen für den Einsatz in vitro und in vivo zu liefern.

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Vorgestellt wird ein Protokoll für die Expansion von Gamma-Delta (γδ) T-Zell-Arzneimittel. Lymphozyten werden durch Elutriation isoliert und γδ-angereichert mit Zoledronsäure und Interleukin-2. Alpha-Beta-T-Zellen werden mit einem magnetischen Trenngerät in klinischer Qualität erschöpft. Die γδ-Zellen werden mit K562-abgeleiteten, künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen ko-kultiviert und expandiert.

Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Transduktion primärer menschlicher T-Zellen mit einem Gen von Interesse, um die Kompatibilität mit den GMP-Standards (Good Manufacturing Practice) sicherzustellen.

Ein GMP-konformes Verfahren zur Erzeugung genmodifizierter T-Zellen

Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess für chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für den klinischen Einsatz, insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Zellprozessors, der in der Lage ist, virale Transduktion und Kultivierung von T-Zellen durchzuführen. Wir geben Empfehlungen und beschreiben Fallstricke, die bei der Prozessentwicklung und Durchführung einer frühen klinischen Studie berücksichtigt werden sollten.

Herstellung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf einem automatisierten Zellprozessor

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie zur Erzielung eines hocheffizienten gezielten Knock-ins von großen, multicistronischen Konstrukten in primären humanen T-Zellen über den Homologie-vermittelten Endverbindungsweg (HMEJ) zur Verfügung gestellt. T-Zellen, die mit diesem cGMP-adaptierbaren Protokoll hergestellt wurden, behalten eine hervorragende Zellexpansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion bei.

Nicht-virales Engineering von primären humanen T-Zellen durch Homologie-vermittelte Endverknüpfung und gezielte Integration großer DNA-Templates

Erfahren Sie die effiziente Expansion von CAR-T- und CIK-Zellen in G-Rex-Geräten für die adoptive Zelltherapie. Diese skalierbare Methode ermöglicht robustes Zellwachstum mit minimaler Benutzerintervention für klinische Anwendungen.

Effiziente und schnelle Erzeugung von CAR-T- und zytokininduzierten Killerzellen in GMP-skalierbaren Geräten

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