Lokalisierung der Plasmamembran und intrazellulärer neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren mittels quantitativer Bildgebung in Säugetierzellen

Das Verständnis des Traffics von nikotinhaltigen Acetylcholinrezeptoren zu Plasmamembranen von Säugetieren ist entscheidend für die Untersuchung der chaperonvermittelten Regulation und die Bewertung zielselektiver Therapien. Ein wesentlicher Vorteil pH-empfindlicher Sonden in Kombination mit einer lebenden Zell-Konfokalmikroskopie ist die hohe räumliche Auflösung der Subunit-Position. Zunächst erwärmen Sie die Reagenzien auf 37 Grad Celsius.

Taue die nAChR-Untereinheit DNase vollständig auf und bringe das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur. Reinigen Sie alle Reagenzien mit 70 % Ethanol, bevor Sie sie in den Biosicherheitsschrank legen. Um Alpha-7 nAChRs in einer Mikrozentrifugenröhre zu exprimieren, verdünnen Sie Alpha-7- und NACHO-Plasmid-DNase in ein reduziertes Serummedium.

Mischen Sie vorsichtig durch Pipettern nach der DNA-Zugabe. Alternativ können Sie zur Expression von Alpha-4-Beta-2-Rezeptoren 4 Mikrogramm jeder Untereinheits-DNA auf insgesamt 250 Mikroliter reduziertes Serummedium verdünnen und vorsichtig mischen. Anpassung der Untereinheitenverhältnisse, um die Expression spezifischer Rezeptor-Isoformen zu optimieren.

Für Alpha-4-Beta-2-Rezeptoren mit einem zusätzlichen Plasmid werden die gleichen Mengen jeder Plasmid-DNA hinzugefügt. Als Nächstes verdünnen Sie in einer neuen Mikrozentrifugenröhre 8 Mikroliter Transfektionsreagenz tropfweise in 250 Mikroliter reduziertes Serummedium. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die verdünnte DNase mit dem verdünnten Transfektionsreagenz tropfweise in ein Rohr vermischt.

Sanft durch Pipette mischen und 20 Minuten bei Zimmertemperatur bebrüten. Während sich Komplexe bilden, ersetzen Sie das Medium in den Kulturschalen durch 1 Milliliter serumfreies EMEM. Fügen Sie jedem Gericht tropfenweise 500 Mikroliter des DNA-Transfektionsreagenzkomplexes hinzu.

Mische vorsichtig, indem du den Teller bewegst, damit sie sich gleichmäßig verteilt, besonders auf der Glasfläche. Die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius ausbrüten und das Medium nach 4-6 Stunden ersetzen. Entfernen Sie das alte Medium durch Absaugung.

Spülen Sie die Schüssel dreimal mit jeweils zwei Millilitern PBS für 10 Minuten bei Zimmertemperatur. Dann fügen Sie 2 Milliliter pH-7,4-Bildpuffer in die Schale ein. Setzen Sie die Bildschüssel in den Objektträger eines Konfokalmikroskops ein und setzen Sie den Halter in die vorgewärmte Umweltkammer.

Schließen Sie das Schlauch der peristaltischen Pumpe an den Halter der Bildgeschirrschale an und schließen Sie die Umweltkammer. Starten Sie nun die Bildgebungssoftware und wählen Sie Laser für die interessierten Fluorophore aus. Scanne die Schüssel, um Zellen für die Bildgebung mit einem 10-60-fachen Ziel zu lokalisieren.

Erhöhen Sie die Vergrößerung bei Bedarf und passen Sie die Fokustiefe bei Bedarf an. Wählen Sie die bevorzugte Auflösung und nehmen Sie ein einzelnes Bild mit dem gewünschten Ziel auf. Notiere den Standort auf der Schüsselkarte, um dieselben Zellen nach dem Pufferwechsel neu zu verlagern.

Wiederholen Sie die Bildaufnahme für mehrere Bereiche der Schüssel mit denselben Aufnahmeeinstellungen für alle Bilder. Wenn nur die Auslassleitung mit der Peristaltikpumpe verbunden bleibt, saugt man langsam den pH-7,4-Puffer aus der Schale in einen Abfallbehälter ab. Dann wird die Einlassleitung auf den pH-5,5-Abschreckpuffer übertragen.

Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein, um einen pH-5,5-Puffer mit einer Durchflussrate von 1,5 Millilitern pro Minute hinzuzufügen und sicherzustellen, dass die Zellen verbunden bleiben. Nach 20 Minuten schalten Sie die Pumpe aus und inkubieren Sie die Zellen im Puffer für weitere 20 Minuten, um ein Gleichgewicht zu ermöglichen. Nach der Inkubation wiederholen Sie die Aufnahmen der gespeicherten Orte.

Um mit der Bildquantifizierung zu beginnen, öffnen Sie ImageJ und laden Sie das zu analysierende Bild. Das Bild wird als Stapel angezeigt, wobei jeder aufgenommene Kanal im selben Bild angezeigt wird. Navigiere zum Phasenkanal.

Wenn das Bild zu hell erscheint, wähle Verarbeiten und Kontrast verbessern und dann auf OK klicken. Nutzen Sie das Lupenwerkzeug, um auf eine Zelle heranzuzoomen. Verwenden Sie das freihändige Auswahlwerkzeug, um die Umrisse der Zelle im Phasenkanal nachzuzeichnen. Wechsel dann zu dem fluoreszierenden Kanal, der dem interessierenden Fluorophor entspricht.

Stellen Sie die gewünschten Messungen ein, indem Sie Analysieren auswählen und auf Messungen festlegen klicken. Stellen Sie sicher, dass Flächen-, Mittel-Grauwert und integrierte Dichte überprüft werden. Um den ausgewählten Bereich zu messen, wählen Sie Analysieren und klicken Sie dann auf Messung.

Führen Sie drei Hintergrundmessungen durch, indem Sie leere Flächen in der Nähe der ausgewählten Zelle nachzeichnen. Nach der Durchführung der Messungen für alle gewünschten Zellen kopieren und fügen Sie die Messdaten zur Analyse in Excel ein. Berechnen Sie dann den durchschnittlichen Hintergrundmittelwert aus den drei Hintergrundmessungen.

Berechnen Sie die korrigierte totale Zellfluoreszenz oder CTCF-Wert für jede Zelle mit der angegebenen Formel. Mit demselben Workflow analysieren Sie Bilder, die nach dem Pufferwechsel aufgenommen wurden. Exportiere alle Ergebnisse in eine Datenanalysesoftware zur statistischen Verarbeitung.

Eine schwache Alpha-BTX-Färbung von AF647 wurde in nicht transfektierten N2a-Zellen beobachtet, während eine robuste Punktat-Markierung in Zellen, die mit Alpha-7-DNA transfiziert wurden, nachgewiesen wurde. Die Quantifizierung bestätigte, dass die Plasmamembranexpression von Alpha-7-nAChRs in alpha-7-transfektierten N2a-Zellen signifikant höher war als in nicht-transfektierten Kontrollgruppen. Bei pH 7,4 war die gesamte Alpha-7-pHuji-Fluoreszenz an der Plasmamembran sichtbar.

in transfektierten N2a-Zellen. Bei pH 5,5 war die Fluoreszenz von Alpha-7 pHuji reduziert, was eine interne Rezeptorlokalisierung offenbarte. Die externe Fluoreszenz des alpha-7-pHuji-Rezeptors war für den Großteil der Rezeptorexpression verantwortlich.

Die Quantifizierung zeigte, dass 82,6 % der Alpha-7-pHuji-Rezeptoren auf der Plasmamembran lagen, während 17,4 % intern waren. Die Fluoreszenz wurde bei der Rückkehr auf pH 7,4 wiederhergestellt, was die Umkehrbarkeit des pHuji-Signals bestätigte. Bei pH 7,4 zeigten N2a-Zellen, die Alpha-4 SEP und Beta-2 pHuji exprimieren, eine robuste Membranfluoreszenz für beide Untereinheiten.

Bei pH 5,5 wurde die Fluoreszenz abgeschreckt, was auf eine interne Lokalisierung einiger Alpha-4-SEP- und Beta-2-pHuji-Untereinheiten hinweist. Die Quantifizierung zeigte, dass 76,5 % des Alpha-4-SEP an der Plasmamembran und 23,4 % intern waren. In dreifach transfifektierten Zellen zeigte die Alpha-4-SEP 82,8 % Membranlokalisierung und 17,2 % interne Expression.

In denselben Zellen waren 63,4 % der Beta-2-pHuji-Untereinheiten auf der Membran lokalisiert, während 36,6 % intrazellulär waren. Mit dem vorgestellten Protokoll charakterisierten wir neuartige Effekte des Chaperons auf die Expression und den Transport nikotinischer Rezeptoren und evaluierten neue zielselektive Therapeutika. Ein Vorteil unseres Protokolls ist die Anpassungsfähigkeit für homomere und heteromere nikotinische Rezeptoren, was die Quantifizierung der relativen zellulären Lage ermöglicht.

Unser Ansatz ermöglicht eine schnelle, robuste Expression der nikotinischen Rezeptor-Plasmamembran, was die Analyse des mit Begleiter vermittelten Handel und die Wirkstoffforschung unterstützt.