Name: Lokalisierung der Plasmamembran und intrazellulärer neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren mittels quantitativer Bildgebung in Säugetierzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Lokalisierung neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren in Säugetierzellen mittels pH-sensitiver Fluoreszenzmarkierung und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Membran- und intrazellulären Rezeptorpopulationen.

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<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA (1X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Zellabtrennungsreagenz</td></tr><tr><td>Alpha-Bungarotoxin Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>B35450</td><td>Alpha-Bungarotoxin-Konjugat</td></tr><tr><td>BSL-Level 1 Biosicherheitskabinett&nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Arbeitsbereich für sterile Zellkulturen</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9224</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>EMEM mit L-Glutamin</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Zellmedium</td></tr><tr><td>Endotoxinfreie DNA</td><td>Hergestellt im Haus mit Zymo-Bausätzen</td><td>Nicht anwendbar</td><td>nAChR-DNAs, die für zelltransienten Transfektionen verwendet werden sollen</td></tr><tr><td>Endotoxinfreie Mikrozentrifugenröhren, 0,5 mL&nbl;</td><td>Aventor/VWR</td><td>89000-010</td><td>DNA- und Transfektionsvorbereitung</td></tr><tr><td>Endotoxinfreie Mikrozentrifugenröhren, 1,5 mL&nbl;</td><td>Aventor/VWR</td><td>20170-038</td><td>DNA- und Transfektionsvorbereitung</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Aventor/VWR</td><td>97068-085</td><td>Serumpräparat</td></tr><tr><td>Fluoview FV10i</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>MatTek-Schüsseln mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>Bildgeräte</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v. 10</td><td>GraphPad-Prisma</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td>Datenanalyse-Software</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>H3375</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Magnesiumchloridhexahydrat</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>413410025</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>MES-Hydrat</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>M5287</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>mTagBFP2-pBAD</td><td>AddGene&nbsp;</td><td>54572</td><td>Kontroll-DNA soll für zelltransienten Transfektion verwendet werden&nbsp;</td></tr><tr><td>Neuro 2 a (N2a) Zellen</td><td>Sammlung der amerikanischen Typkultur</td><td>CCL-131</td><td>Zellen, die für DNA-Transfektionen und nAChR-Expression verwendet werden</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Reduziertes Serummedium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Aventor/VWR</td><td>K952-100mL</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Peristaltikpumpe</td><td>Gilson</td><td>MiniPuls3</td><td>Pufferänderungen beim Imaging&nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Qualitätsbiologisch</td><td>119-069-131</td><td>Kochsalzpuffer</td></tr><tr><td>Pipethilfe</td><td>Drummond&nbsp;</td><td>140084</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Pipetspitzen (steril und endotoxinfrei, 1000 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389216</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Pipetspitzen (steril und endotoxinfrei, 20 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389229</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Pipetspitzen (steril und endotoxinfrei, 250 μL)</td><td>Rainin</td><td>30389246</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Pipetten, P10</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-10XLS</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Pipetten, P100</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-100XLS</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Pipetten, 1000 Pesos</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>L-1000XLS</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>MilliPore Sigma&nbsp;</td><td>P3911</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>Serologische Pipeten (steril und endotoxinfrei, 10 ML)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-898</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Serologische Pipeten (steril und endotoxinfrei, 25 ml)</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-900</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Serologische Pipets (steril und endotoxinfrei, 5 ml)</td><td>Aventor/VWR</td><td>76201-710</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Serologische Pipeten (steril und endotoxinfrei, 50 ml)</td><td>Aventor/VWR</td><td>75816-088</td><td>Präziser Flüssigkeitstransfer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9286</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>Tissue Culture Flask</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td>Gerichte anbauen</td></tr><tr><td>ZymoPure II Plasmid Maxiprep Kit</td><td>ZYMO-FORSCHUNG</td><td>D4203-A + D4203-B</td><td>Produktion endotoxinfreier DNA</td></tr><tr><td>&alpha; 4-SEP&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific GeneArt Gensynthese Services&nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Individuelle Gensynthesedienste</td></tr><tr><td>&alpha; 7-pHuji</td><td>Twist Bioscience</td><td>https://www.twistbioscience.com/</td><td>Individuelle Gensynthesedienste</td></tr><tr><td>&Beta; 2-pHuji</td><td>ThermoFisher Scientific GeneArt Gensynthese Services&nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>Individuelle Gensynthesedienste</td></tr></tbody></table>

lokalisierung der plasmamembran und intrazellulärer neuronaler nikotinischer acetylcholinrezeptoren mittels quantitativer bildgebung in säugetierzellen

Localization of Plasma Membrane and Intracellular Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors Using Quantitative Imaging in Mammalian Cells

Lokalisierung der Plasmamembran und intrazellulärer neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren mittels quantitativer Bildgebung in Säugetierzellen

Quantification of neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) expressed on the plasma membrane of mammalian cells is important for the development ...

localization-plasma-membrane-intracellular-neuronal-nicotinic

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir haben eine neue Technik zur Quantifizierung nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors Veränderungen innerhalb subzellulären Regionen spezifischen Subtypen von ZNS-Neuronen zum besseren Verständnis der Mechanismen der Nikotinabhängigkeit, indem eine Kombination von Ansätzen einschließlich fluoreszierendes Protein Markierung des Rezeptors mit dem Knock-in-Ansatz entwickelt und spektrale konfokale Bildgebung.

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Durch die Kennzeichnung die extrazellulären Domänen von Membranrezeptoren mit superecliptic pHluorin, und durch Abbilden diese Fusion Rezeptoren in kultivierten Maus Neuronen, können wir direkt visualisieren einzelnen vesikulären Insertionsereignisse der Rezeptoren in der Plasmamembran. Diese Technik wird maßgeblich bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Rezeptor-Insertion in die Plasmamembran.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

Quelle: Zhang, J., et al. Hochauflösende quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren an retinalen Bandsynapsen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt eine elektronenmikroskopische Technik zur Visualisierung der Lokalisierung von Neurotransmitterrezeptoren in retinalen Synapsen. Die Netzhautschnitte enthalten retinale Ganglienzellen, die membrangebundene Neurotransmitterrezeptoren aufweisen und mit der Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) markiert sind. Nach der Markierung der Marker mit...

Hochauflösende Bildgebung von Neurotransmitter-Rezeptoren an retinalen Synapsen

In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Wir haben ein gen-chimäres Präparat des ventralen Hippocampus-Accumbens-Schaltkreises in vitro entwickelt, das eine direkte Live-Bildgebung ermöglicht, um präsynaptische Mechanismen der durch nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) vermittelten synaptischen Übertragung zu analysieren. Dieses Präparat bietet auch einen informativen Ansatz zur Untersuchung der prä- und postsynaptischen Mechanismen der synaptischen Plastizität.

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Die Postembedding-Immunogold-Methode ist eine der effektivsten Methoden, um hochauflösende Analysen der subzellulären Lokalisation spezifischer Moleküle zu liefern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Analyse von Glutamatrezeptoren an retinalen Bandsynapsen.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung von Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) in Maus Hirnschnitten von Nikotin uncaging. Wenn gepaart mit gleichzeitiger Patch Clamp Aufnahme und 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie, verbindet Nikotin uncaging Nikotinsäure Rezeptor-Funktion mit zellulären Morphologie, bietet ein tieferes Verständnis der cholinergen Neurobiologie.

Sondieren Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Gehirnscheiben per Laser Flash Photolyse von Photoactivatable Nikotin

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Erfahren Sie die Lokalisierung neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren in Säugetierzellen mittels pH-sensitiver Fluoreszenzmarkierung und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Membran- und intrazellulären Rezeptorpopulationen.

Lokalisierung der Plasmamembran und intrazellulärer neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren mittels quantitativer Bildgebung in Säugetierzellen (Video) | JoVE Journal

Lokalisierung der Plasmamembran und intrazellulärer neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren mittels quantitativer Bildgebung in Säugetierzellen

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