Erstellung eines auf Prostataorganoiden basierenden Mausmodells zur Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen
February 27th, 2026
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines auf Maus basierenden Prostataorganoidenmodells, das in 2D gezüchtet wurde. Dazu gehören Organoid-Dissoziation, Zellaussaatung, Differenzierung, Bewertung der Epithelintegrität und In-vitro-Infektionen mit uropathogenen Escherichia coli. Das Modell bietet apikale Zugänglichkeit und eignet sich für die Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen, wodurch die Einschränkungen traditioneller 3D-Organoidsysteme überwunden werden.
Diese Forschung konzentriert sich darauf, zu verstehen, wie bakterielle Krankheitserreger das Prostataepithel infizieren und welche Interaktionen zwischen Wirtspathogenen das Infektionsergebnis bestimmen. Bestehende In-vitro-Modelle erfassten die prostataepitihelale Diversität nur schlecht. Dieses Modell bietet ein physiologisch relevantes System, das die unterschiedlichen Zelltypen im Gewebe widerspiegelt.
Zu Beginn werden dreidimensionale murine Prostataorganoide kultiviert, die auf Tropfen extrazellulärer Matrix in einer 24-Well-Platte kultiviert werden. Aspiratiere das Medium aus der gewünschten Anzahl von Brunnen und gib jedem Bohrloch 500 Mikroliter frisches Kulturmedium hinzu. Mit einer P-1000-Pipette wird der extrazelluläre Matrixabfall in jedem Brunnen mechanisch gestört.
Sammeln Sie diese Suspension in einem 15-Milliliter-konischen Rohr mit nicht mehr als zwei Brunnen pro Rohr. Fügen Sie frisches Kulturmedium hinzu, um das Volumen auf 10 Milliliter zu bringen. Wenden Sie das Rohr vorsichtig drei- bis viermal um, um es zu mischen, und zentrifugieren Sie es bei 450 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Aspiriere das Supernatant. Das Pellet in zwei Millilitern Enzymlösung wieder suspendieren, auf 37 Grad Celsius vorwärmen und die Suspension 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Mit einer P-1000-Pipette wird die Zellsuspension während der Inkubation alle fünf Minuten gemischt.
Nach der Brutzeit wird frisches Kulturmedium hinzugefügt, um ein Endvolumen von 10 Millilitern zu erreichen. Wenden Sie das Rohr vorsichtig drei- bis viermal um, um zu mischen. Zentrifugiere bei 450 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Saugen Sie das Supernatant ab, ohne das Pellet zu stören. Das Pellet in 300 Mikrolitern Kulturmedium mit 10 Mikromolargesteinsinhibitoren aufgehängt. Mit einer Neubauer-Zählkammer zählen Sie die Zellen in der Suspension.
Verdünnen Sie die Suspension auf eine Konzentration von 62.500 Zellen pro Milliliter in einem Kulturmedium, ergänzt mit einem 10-mikromolaren Gesteinsinhibitor. Dann werden 200 Mikroliter der Suspension pro Bohrloch für eine 48-Bohrloch-Platte und 300 Mikroliter pro Bohrloch für Kammer-Mikro-Objektträger ausgesaat. Inkubieren Sie die Platten in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Nach einem Tag prüfen Sie, ob die meisten einzelnen Zellen an der zweidimensionalen Kulturoberfläche angeheftet sind. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle zwei bis drei Tage und setzen Sie die Kultur fort, bis innerhalb von sieben Tagen eine Zusammenfluss erreicht ist. Um die Differenzierung zur Anreicherung von luminalen Zellen anzuregen, geben Sie während der Aussaat 10 nanomolare von fünf Alpha-Dihydrotestosteron oder DHT zur Zellsuspension.
Den uropathogenen Escherichia-coli-Stamm, oder UPEC, auf eine LB-Agarplatte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin auftragen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden. Mit einem sterilen Loop-Inokulat Drei Milliliter LB-Brühe, ergänzt mit 100 Mikrogramm Ampicillin pro Milliliter und einer einzelnen Bakterienkolonie.
Inkubiere die Kultur statisch bei 37 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden. Vortex die Bakterienkultur über Nacht. Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern.
Berechnen Sie dann das Kulturvolumen, das benötigt wird, um eine anfangsoptische Dichte von 0,05 in drei Millilitern Brühe zu erreichen. Fügen Sie das berechnete Volumen der Bakterienkultur der frischen, mit Ampicillin angereicherten LB-Brühe hinzu. Inkubieren Sie statisch bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.
Nach der Inkubation wird die Bakterienkultur vortexiert. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern. Berechnen Sie das Kulturvolumen, das benötigt wird, um eine optische Dichte von eins zu erreichen.
Zentrifugiere das benötigte Volumen bei 12.000 g für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Aspiriere und entsorge das Supernatantant. Das bakterielle Pellet in einem Milliliter Primus und freiem Organoid-Kulturmedium ohne DHT wieder suspendieren.
Anschließend wird die Suspension mit einem Prostata-Organoidkulturmedium der Maus verdünnt, um eine Infektionsmultiplizität von 100 zu erreichen. Aspiratiere das Kulturmedium aus dem vorbereiteten organoidbasierten Modell. Fügen Sie 200 Mikroliter Kulturmedium mit Bakterien zu jedem Brunnen einer 48-Well-Platte hinzu.
Inkubieren Sie eine Stunde lang in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Aspirieren Sie das bakterienhaltige Medium aus den Brunnen und waschen Sie die Bohrungen dreimal mit frischem Kulturmedium, um extrazelluläre Bakterien zu entfernen. Anschließend fügen Sie ein Kulturmedium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten.
Aspiriere das Medium. Frisches Kulturmedium hinzufügen, ergänzt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin für die verbleibende Infektionszeit. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die infizierten Zellen nach der fluoreszierenden Färbung abzubilden und infizierte Zellen mit einem Durchflusszytometer zu quantifizieren.
Im Kontrollzustand ohne Dihydrotestosteron waren die meisten Zellen Cytokeratin, fünf positive Basalzellen, nur wenige zeigten eine niedrige CD 24 8 luminale Expression. Die Supplementierung mit einem nanomolaren DHT führte zu gemischten basalen luminalen Populationen, obwohl CD 24 A niedrig blieb. Die Erhöhung des DHT auf 10 nanomolare förderte die Differenzierung in luminale Zellen, während einige Basalzellen nach sieben Tagen Kultur erhalten blieben.
Dies korrelierte mit Quantifizierungsstudien, die eine Abnahme der Cytokeratin-5-positiven Basalzellen und eine Zunahme der CD-24A-positiven luminalen Zellen mit zunehmender DHT-Konzentration im Laufe der Zeit zeigten. Null Stunden nach der Infektion haftete UPEC in hoher Zahl an Epithelzellen. Nach einer einstündigen Gentamycin-Behandlung sank die Anzahl der UPEC-positiven Zellen stark.
Nach 24 Stunden waren die infizierten Zellzahlen ähnlich wie bei einer Stunde. Konfokale Bildgebung nach 24 Stunden zeigte, dass intrazelluläre Bakterien sich weiterhin vermehrten und gemeinschaftsähnliche Cluster bildeten. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Dynamik bakterieller Infektionen und deren Interaktionen mit Erregern in einem Modell zu untersuchen, das die epitheliale zelluläre Vielfalt bewahrt.
Zukünftige Studien können dieses Modell nutzen, um verschiedene Prostataerkrankungen zu untersuchen, darunter Infektionen, Krebsbiologie und potenzielle therapeutische Verbindungen zu testen.
Overview
This article presents a step-by-step protocol for generating a two-dimensional (2D) culture model derived from mouse prostate organoids. The model maintains key epithelial characteristics and allows direct access to the apical surface, enabling detailed studies of host-pathogen interactions, particularly with uropathogenic Escherichia coli (UPEC). The protocol includes organoid dissociation, cell seeding, differentiation, and infection procedures, validated by immunofluorescence and functional assays.
Key Study Components
Area of Science
- Prostate epithelial biology
- Host-pathogen interactions
- Organoid and cell culture models
Background
- Prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia, prostatitis, and prostate cancer are prevalent in aging men.
- Organoid models replicate epithelial structure and function but limit access to the apical surface.
- Existing in vitro models do not fully capture the diversity of prostatic epithelial cells.
- Improved models are needed to study infection dynamics and disease mechanisms.
Purpose of Study
- To develop a physiologically relevant 2D culture system from mouse prostate organoids.
- To enable direct experimental access to the apical surface for infection studies.
- To validate the model's epithelial diversity and suitability for host-pathogen interaction research.
Methods Used
- Dissociation of mature mouse prostate organoids cultured in extracellular matrix.
- Seeding of dissociated cells onto 2D culture surfaces with optimized conditions for attachment and proliferation.
- Differentiation induction using dihydrotestosterone (DHT) supplementation.
- Infection of the 2D model with UPEC and analysis via immunofluorescence microscopy, TEER measurements, and flow cytometry.
Main Results
- The 2D model retained essential epithelial characteristics and cellular diversity.
- DHT supplementation modulated the balance between basal and luminal cell populations.
- UPEC adhered to and invaded epithelial cells, forming intracellular clusters observed by confocal microscopy.
- Gentamycin treatment effectively reduced extracellular bacteria, allowing study of intracellular infection dynamics.
Conclusions
- The 2D organoid-derived model provides a robust platform for studying prostate epithelial biology and host-pathogen interactions.
- It enables detailed investigation of infection dynamics and cellular responses.
- The model is suitable for future studies on prostate diseases and therapeutic testing.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Prostate organoid-derived 2D models address a critical gap in preclinical research by enabling direct interrogation of host-pathogen interactions at the epithelial barrier. This system preserves cellular diversity and barrier function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for infection and prostate disease research. The platform's translational relevance positions it as a reusable asset for portfolio-wide evaluation of disease mechanisms and therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of epithelial responses to uropathogenic Escherichia coli infection.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a physiologically relevant context.
- Facilitates biological de-risking by modeling both basal and luminal cell populations.
- Improves predictive confidence for downstream infection biology studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible 2D epithelial system for quantitative infection assays.
- Enables direct access to the apical surface for compound or pathogen application.
- Supports TEER and immunofluorescence-based readouts for barrier integrity and cell differentiation.
- Allows scalable preparation for high-content screening of infection-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant epithelial biology for translational infection and prostate disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of host-pathogen mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting epithelial infection pathways.
- Supports evaluation of candidate interventions in a system reflecting in vivo cellular diversity.
Pipeline & Workflow Integration
This organoid-based 2D model bridges early discovery and preclinical infection research, enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative readouts within a unified workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of infection mechanisms and epithelial responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection and barrier function assays for compound evaluation.
- Analytics: Provides immunofluorescence, TEER, and flow cytometry outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease-relevant cellular organization for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse prostate disease and infection studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection biology.
- Operational Value: Standardizes epithelial infection assays with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of infection and prostate disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, epithelial differentiation, and infection assays.
- Needs access to immunofluorescence microscopy, TEER instrumentation, and flow cytometry.
- Demands cross-team standardization of cell seeding, differentiation, and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial models with protocol optimization for tissue specificity.
- Barrier function and cellular diversity must be validated for each experimental batch.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
