Eine einfache Mikroaspirationstechnik zur Isolierung somatischer Zellen aus kryokonserviertem Pferdesamen als Kernspender für das Klonieren

Wir wollen zeigen, dass somatische Zellen aus kryokonserviertem Pferdesamen nützlich sein können, um Individuen mit hohem genetischen Wert zu recupmerieren. Unsere aktuelle Herausforderung besteht darin, somatische Zellen mit intakter diploider DNA als Kernspender auswählen zu können. Zunächst entferne die Pferdesamen-Strohhalme aus dem flüssigen Stickstofftank.

Setzen Sie sie 10 Sekunden Luft aus und tauen Sie sie 30 Sekunden lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Nehmen Sie eine 250-Mikroliter-Probe des aufgetauten Samens. Verdünnen Sie es mit einem Milliliter zugesetztem DMEM-F12-Medium.

Inkubieren Sie die Samenmischung bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Pipettieren Sie 25 Mikroliter aus der inkubierten Verdünnung in ein Rohr und verdünnen Sie es in 975 Mikrolitern DPBS, ergänzt mit 0,1 Milligramm Polyvinylalkohol pro Milliliter oder Polyvinylpyrrolidon. Mische die Federung vorsichtig.

Halten Sie die verdünnte Samenmischung während des gesamten Zellentnahmeprozesses bei 37 Grad Celsius. Setzen Sie einen Petrischalendeckel mit verdünntem Pferdesamen auf die Mikroskopstufe, um die somatische Zellentnahme vorzubereiten. Wählen Sie eine Mikropipette mit geeignetem Durchmesser für die somatische Zellentnahme aus und verbinden Sie sie mit dem mechanischen Aspirationssystem.

Führe die Mikropipette vorsichtig in den Mikrotropfen ein und richte sie am Boden des Geschirrdeckels aus. Sobald die Pipette das Kulturmedium aspiriert, beginnt die individuelle Erfassung somatischer Zellen. Konzentrieren Sie sich auf den unteren Teil des Mikrotropfens, wo verschiedene Zellmorphologien sichtbar sind.

Positioniere die Mikropipettenspitze neben jede somatische Zelle und aspiriere unter negativem Druck. Sammeln Sie alle runden und verlängerten Zellen, unabhängig von der Größe. Nachdem Sie 10 Zellen gesammelt haben, legen Sie sie in einen 10-Mikroliter-Mikrotropfen, der sich auf der Oberseite des Geschirrdeckels befindet.

Behalte alle gesammelten somatischen Zellen während des gesamten Entnahmeprozesses in diesem Mikrotropfen. Sobald die gewünschte Anzahl somatischer Zellen gesammelt ist, führen Sie ein einfaches Waschverfahren mit Mikrotropfen durch, um Spermien, Ablagerungen und mikrobielle Verunreinigungen zu entfernen. Mit einem zweiten Schüsseldeckel führen Sie eine sequentielle dreistufige Waschung der somatischen Zellen durch.

Verwenden Sie eine Mikropipette, um die somatischen Zellen in den ersten Tropfen zu übertragen, und lassen Sie sie drei bis fünf Minuten absinken. Übertragen Sie die Zellen vom ersten auf den zweiten Tropfen mit demselben Verfahren. Wiederhole den Transfer noch einmal und setze die somatischen Zellen in den dritten Tropfen.

Abschließend werden die isolierten somatischen Zellen in einen vorbereiteten Mikrotropfen abgelagert, der für den somatischen Zellkerntransfer bestimmt ist. Die Mikroaspirationstechnik gelang erfolgreich somatischen Zellen aus kryokonserviertem Pferdesamen, mit Fangraten von 317,7 bis 424,7 Zellen pro Stunde über drei Hengste. Hengst Nummer 3 zeigt den höchsten Ertrag.

Fünf unterschiedliche somatische Zelltypen wurden basierend auf Größe und Morphologie identifiziert. Wir identifizierten eine Population somatischer Zellen, die sich in Morphologie und Lebensfähigkeit im kryokonservierten Pferdesamen unterscheiden, was als Kernspender nützlich sein könnte. Die Zellen können anhand ihrer Morphologie ausgewählt werden, und das Verfahren erfordert keine Primärkultur.

Wir konzentrieren uns darauf, die Lebensfähigkeit dieser Zellen nach dem Bulken des Pferdesamens zu verbessern.