Peroxisom-Färbung in Säugetierzellen mittels peroxisom-spezifischen Sonden

Unsere Forschung konzentriert sich daher auf das Verständnis von Peroxisomen, die essentielle Organellen für den Lipidstoffwechsel und das zelluläre oxidative Gleichgewicht sind. Wir wollen herausfinden, wie ihre Struktur und Funktion reguliert werden und wie sich diese Prozesse im Verlauf der Krankheit verändern. Um dies zu erreichen, entwickeln wir fluoreszierende Sonden, die es uns und der breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft ermöglichen, Peroxisome in verschiedenen tierischen Zellen sichtbar zu machen.

Hier entwickeln wir Färbeprotokolle, die sowohl in lebenden als auch in fixierten Zellen wirken und leistungsstarke Werkzeuge zur Untersuchung der Paroxetinbiologie in Gesundheit und Pathologie bereitstellen. Eine der größten experimentellen Herausforderungen ist die nicht-invasive Markierung von Peroxisomen in tierischen Zellen. Während Antikörperfärbung hilft, dies zu überwinden, fehlt es an kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen paroxysmale Proteine.

Eine weitere Herausforderung besteht darin, Peroxisome nicht-invasiv in Echtzeit zu visualisieren, was anpassungsfähige Protokolle erfordert. Und schließlich liefert herkömmliches Beizen keine funktionale Anzeige. Während die peroxidasebasierte Färbung je nach paroxysmaler Funktion variieren kann, was sowohl eine Herausforderung als auch eine Chance darstellt, da sie es ermöglicht, paroxysmale funktionelle Zustände innerhalb der Zelle zu unterscheiden.

Beginnen Sie mit Säugetierzellen, die am Tag zuvor in einer Platte mit Deckungsbegrenzungen ausgesät wurden, die nun bei einer Konfluenz von 30 bis 70 % liegen. Verdünnen Sie die Peroxisom-Sonde mit frischem Medium in einem lichtempfindlichen, mikrozentrifugierten Rohr, um eine Endkonzentration von vier Mikromolaren zu erreichen. Wählen Sie den gewünschten Brunnen zum Beizen aus und beschriften Sie die Außenseite mit einem Markerstift.

Saugen Sie 0,5 Milliliter Medium aus dem ausgewählten Brunnen ab und ersetzen Sie es durch das vorbereitete Probemedium tropfen für tropfen entlang der Wand des Bohrlochs. Nach der Abgabe inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Ab diesem Punkt schützen Sie die Zellen mit Alufolie vor Licht.

Nach der Inkubation entferne das gefärbte Medium vorsichtig und wasche die Zellen zweimal mit PBS. Dann wird die Platte unter eine chemische Haube gelegt, 4 % Paraformaldehyd in PBS zu den Zellen gegeben und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Fixierung entfern Sie das Paraformaldehyd in einen speziellen Abfallbehälter und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.

Als Nächstes gib 0,5 % Triton X in PBS hinzu, um die Zellen zu permeabilisieren, und inkubiere 2,5 Minuten. Nach der Inkubation entfernen Sie das Triton X und waschen Sie die Zellen jeweils zweimal mit PBS für jeweils 10 Minuten. Um die Zellen zu blockieren, inkubieren Sie sie mit 5 % Rinderserumalbumin in PBS über Nacht bei vier Grad Celsius.

Führen Sie das immunfluoreszierende Färbeverfahren gemäß dem Standardprotokoll durch. Führen Sie schließlich eine Mikroskopie durch, um Bilder sowohl von fixierten als auch von lebenden Zellen zu machen. Die Färbung von lebenden Zellen mit Peroxi_SPY Sonden führte dazu, dass die ATP-bindende Kassettenunterfamilie D-abhängige Importe in Peroxisome eingeführt wurden, was ein hohes Peroxisom-zu-Zytoplasma-Fluoreszenzverhältnis in metabolisch aktiven Zellen erzeugte.

In Wildtyp-HEK-293T-Zellen, die GFP-SKL exprimieren, zeigte Peroxi_SPY555 Färbung eine deutliche Kolokalisation mit Peroxisomen, während bei PEX19-Knockout-Zellen, denen Peroxisome fehlen, die Färbung fehlte. Bei humanen Fibroblasten wurde Peroxi_SPY Färbung kolokalisiert mit dem paroxysmalen Marker GFP-SKL, was die Peroxisom-Zielsetzung bestätigte. Die Quantifizierung der Peroxisomendichte zeigte signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen.

Optimierte Färbebedingungen in COS-7-Zellen mit 250 nanomolaren Peroxi_SPY für 20 Minuten erhöhten das Peroxisom-zu-Zytoplasma-Fluoreszenzverhältnis signifikant im Vergleich zum ursprünglichen Protokoll von einem Mikromolar für 10 Minuten. Eine verlängerte Inkubation von HEK-293T-Zellen mit Peroxi_SPY über 24 Stunden führte zu einem verbesserten Fluoreszenzintensitätsverhältnis zwischen Peroxisom und Zytoplasma im Vergleich zu 15 Minuten, trotz reduzierter Peroxisom-Färbung. Ein Fixierungsprotokoll ermöglichte eine erfolgreiche Antikörper-Kofarbeierung, die durch konservierte Peroxi_SPY-Markierung und Anti-PEX14-Immunfärbung in HuH-7- und HEK-293T-Zellen demonstriert wurde.

Die Quantifizierung zeigte, dass Fixations- und Permeabilisierungsverfahren die Peroxisom-Fluoreszenzintensität im Vergleich zur lebenden Zellfärbung beeinflussten. Wir haben den Peroxi_SPY Farbstoff entwickelt, der verwendet werden kann, um Peroxisome sowohl in lebenden als auch in fixierten Tierzellen sichtbar zu machen. Unsere fluoreszierende Sonde kann eine einfache und schnelle Methode bieten, um Peroxisomendynamik, Heterogenität und Dysfunktion auf eine Weise zu untersuchen, die zuvor begrenzt war.

Dieses Protokoll ermöglicht bildgebende Peroxisomenforschung an verschiedenen Zelltypen, einschließlich patientenabgeleiteter Zellen mit paroxysmalen Erkrankungen.