Modellierung von Gehirnmetastasen: Standardisierte Analyse metastatischer Kolonisierung und histologischer Wachstumsmuster durch stereotaktische intrakortikale Injektion

Unsere Gruppe untersucht, wie Tumorzellen das Gehirn besiedeln und wie metastasierte Wachstumsmuster klinische Ergebnisse und Behandlungsreaktionen beeinflussen. Zu Beginn wiegt man jede Maus mit einer Präzisionswaage, um das erforderliche Volumen an Anästhetikum basierend auf ihrem Körpergewicht zu berechnen. Nach der Verabreichung des Betäubungsmittels wird die Maus auf ein vorwarmes Heizkissen gelegt, das bei 37 bis 38 Grad Celsius gehalten wird, um die Thermoregulation zu unterstützen, und dann Augensalbe auftragen, um die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen.

Bereiten Sie die Maus mit aseptischer Technik vor, die vom örtlichen Tierethikausschuss genehmigt ist. Desinfizieren Sie die Kopfhaut gründlich mit einer jodbasierten Lösung. Überprüfen Sie die Dichte der Anästhesie mit einem Zehenkniff, strecken Sie dann die Haut straff und machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen Mittellinienschnitt von etwa drei bis vier Millimetern entlang des Schädels.

Mit demselben Skalpell kratzen Sie vorsichtig das Periost ab, um die Schädeloberfläche freizulegen. Sichern Sie den Kopf der Maus in einem stereotaktischen Rahmen mit Ohrenstangen. Mit dem stereotaktischen Arm lokalisieren Sie das Bregma, bewegen Sie den Arm dann zwei Millimeter nach vorne und einen Millimeter lateral nach rechts und markieren die Zielstelle im Frontallinde mit einem chirurgischen Marker.

Bohren Sie vorsichtig durch den Schädel an der markierten Stelle mit einem präzisen zahnärztlichen Bohrer, um sicherzustellen, dass die Dura Mater nicht durchdrungen wird. Überprüfen Sie die Öffnung, indem Sie die Stelle vorsichtig mit einer sterilen Zangelei abtasten. Als Nächstes wird die Tumorzellsuspension durch Pipettieren auf und ab wieder aufgehängt und eine gleichmäßige Verteilung gewährleistet.

Füllen Sie drei Mikroliter der Federung in eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze und setzen Sie sie mit dem entsprechenden Halter in den stereotaktischen Rahmen ein. Positioniere die Spritzennadel vorsichtig über dem Bohrloch, wobei der Fasen nach links zeigt, damit die Injektion konsistent ist. Führen Sie die Nadel vertikal ins Gehirngewebe bis zu einer Tiefe von 3,5 Millimetern ein.

Sobald die erforderliche Tiefe erreicht ist, ziehen Sie die Nadel langsam um 0,5 Millimeter zurück, um den Rückfluss der Zellsuspension zu verhindern, und injizieren Sie langsam drei Mikroliter der Tumorzellsuspension über eine Minute. Nach der Injektion lassen Sie die Nadel weitere zwei Minuten an Ort und Stelle, damit sich die Zellen und die extrazelluläre Matrix setzen und der Reflux minimiert wird. Dann ziehe die Spritze vorsichtig heraus und entferne die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.

Spülen Sie den Schädel vorsichtig mit steriler 0,9%iger Natriumchloridlösung ab und schließen Sie das Grabenloch mit Knochenwachs ab. Schließen Sie den Kopfhautschnitt mit drei bis vier Nähten, wobei jede Naht mit drei festen Knoten nahe den Wundrändern für eine optimale Heilung verbunden wird. Markieren Sie die Ohren der Maus mit einem passenden Ohrlochmuster, das der angegebenen Identifikationsnummer entspricht.

Anschließend tragen Sie bei Bedarf eine Augensalbe erneut auf, um das Austrocknen der Hornhaut während der Erholung zu verhindern, und legen Sie die Maus wieder auf ein vorwarmes Heizkissen zurück, das bei 37 bis 38 Grad Celsius gehalten wird, um die Erholung von der Anästhesie zu unterstützen. Reinigen und desinfizieren Sie die Hamilton-Spritze gründlich, indem Sie Nadel und Fass dreimal nacheinander abspülen, zuerst mit destilliertem Wasser, dann mit 70 % Ethanol und schließlich mit steriler 0,9 % Natriumchloridlösung. Nach dem Abspülen bewahren Sie die Hamilton-Spritze auf Eis auf, bis sie sie wieder benutzt hat.

Abschließend verabreichen Sie Analgetikum subkutan, während die Maus noch unter Narkose ist, um sofortige postoperative Schmerzlinderung sicherzustellen. Hausmäuse werden während der Erholung einzeln für eine kurze Zeit durchgeführt, höchstens eine Stunde, um Verletzungen durch Interaktionen zwischen wachen und sich erholenden Tieren zu verhindern. Wenn während der Überwachungsphase Anzeichen von Stress oder abnormalem Verhalten festgestellt werden, sollten die neurologischen Funktionen mit dem Hängedrahttest bewertet werden, um Griffstärke und Koordination zu beurteilen.

Hängen Sie eine Maus an einem horizontalen Draht und notieren Sie innerhalb von 60 Sekunden, ob sie eine Fluchtplattform erreicht. Eine nicht gesunde Maus erreicht die Plattform nicht und fällt vom Draht. Nach der Euthanase und dem Sammeln der tierischen Gewebe wird das histologische Wachstumsmuster der Metastase und zugehörige Merkmale auf digitalen Gewebeobjektträgern bewertet.

Makroskopische Bilder bestätigten das Fehlen von Tumorwachstum bei ECM-injizierten Kontrollventil-C-Mäusen, während sichtbare metastasierte Läsionen bei Mäusen vorhanden waren, die mit Tumorzell-ECM-Suspensionen injiziert wurden. Mäuse, die mit 4T1- oder 410,4-Brustkrebszellen injiziert wurden, zeigten eine signifikant höhere metastasierte Belastung im Vergleich zu ECM-injizierten Kontrollen, ohne signifikante Unterschiede zwischen den beiden Tumorzelllinien. Die Überlebensanalyse von Kaplan Meyer zeigte, dass Mäuse, die mit 410,4 Tumorzellen injiziert wurden, eine signifikant längere Gesamtüberlebenszeit aufwiesen als Mäuse mit 4T1-Zellen.

Historische Analysen zeigten, dass 4T1- und 410.4-Hirnmetastasen unterschiedliche Wachstumsmuster aufwiesen, wobei 4T1 kohortenartiges Wachstum zeigte und 410.4 strangartiges epithiales infiltratives Wachstum zeigte. Eine unsachgemäße stereotaktische Injektion führte zu Tumorwachstum im Schädel und in den Meningen aufgrund von Zellsuspensionsleck, während eine korrekte intrakortikale Injektion zu Parenchymalmetastasen mit anschließender meningealer Verbreitung führte. Wir haben gezeigt, dass Wachstumsmuster bei Gehirnmetastasen die Prognose und den neurologischen Tod beeinflussen, was die Relevanz für die Steuerung klinischer Entscheidungsfindung unterstützt.

Dieses Protokoll ist besonders nützlich zur Untersuchung der metastatischen Kolonisierung im späten Zustand, wobei klinisch relevante Aspekte wie Wachstumsdynamik und sekundäre Verbreitung behandelt werden. Im Gegensatz zu anderen Methoden gewährleistet das stereotaktische Modell eine hirnspezifische Besiedlung und bewahrt die vollständige Systemkomplexität, was langfristige Studien zum Tumorfortschritt und zur Therapieansprache ermöglicht. Durch die Bereitstellung einer reproduzierbaren klinisch relevanten Plattform trägt unser Modell dazu bei, die Mechanismen der Gehirnbesiedlung zu verstehen und neue therapeutische Strategien zu erforschen.