Bestimmung der mikrobiellen Biomasse im Boden mittels Digital Droplet PCR (ddPCR)
24. April 2026
Diese Studie präsentiert eine schnelle ddPCR-Methode zur Quantifizierung des Bodenmikroorganismus-Biomasse- und Pilz-zu-Bakterien-Verhältnisses. Obwohl ddPCR-abgeleiteter mikrobieller Biomassekohlenstoff nur eine schwache Korrelation mit Chloroform-Fumigationsschätzungen aufweist, bietet die Methode einen sensiblen, skalierbaren molekularen Ansatz zur Beurteilung der mikrobiellen Häufigkeit ohne zusätzliche Bodenprobennahmen oder den Einsatz von Härte.
Unsere Studie verwendet tropfenbasierte digitale PCR und Ganzgenomsequenzierung, um mikrobielle Biomasse über verschiedene Bodentypen hinweg genau zu quantifizieren. Konventionelle Methoden erfordern große Bodenproben und schädliche Chemikalien. ddPCR verwendet minimalen Boden für die absolute Quantifizierung von Gen- und Biomassekohlenstoff.
Zu Beginn werden die Reagenzien des Boden-DNA-Extraktionssets zusammengestellt, um die DNA von Bodenmikroben bei Raumtemperatur von 20 Grad Celsius zu isolieren. Drehen Sie das Zwei-Milliliter-Perlenschlagrohr kurz und überprüfen Sie, ob die Perlen am Boden liegen. Fügen Sie 100 Milligramm Erde hinzu, dann 800 Mikroliter Lösung CD1 und vortexen kurz zum Mischen.
Verwenden Sie einen Perlenmühlenhomogenisator mit einer Geschwindigkeit von sechs Metern pro Sekunde für 40 Sekunden, um die Probe gründlich zu lysieren, und zentrifugieren Sie das Perlenschlagrohr bei 15.000 g für eine Minute bei Raumtemperatur, um eine mechanische Zelllyse zu erreichen. Übertragen Sie das Überlagermittel, das noch Bodenpartikel enthalten kann, in ein sauberes Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 200 Mikroliter Lösung CD2 hinzu.
Wirbel für fünf Sekunden und Zentrifuge bei 15.000 g für eine Minute. Übertragen Sie bis zu 700 Mikroliter Supernatant in ein sauberes Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 600 Mikroliter Lösung CD3 zum Überstandsmittel hinzu und wirbeln für fünf Sekunden.
Laden Sie 650 Mikroliter der Mischung auf eine Rotationssäule und zentrifugieren Sie mit 15.000 g für eine Minute. Verwerfen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie den Vorgang für das verbleibende Lysat. Als Nächstes werden die Spin-Säule in ein sauberes Zwei-Milliliter-Sammelrohr gelegt.
Gib 500 Mikroliter Lösung EA in die Spin-Säule und zentrifugiere bei 15.000 g für eine Minute bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Spin-Säule zurück in dasselbe Sammelrohr. Fügen Sie 500 Mikroliter Lösung C5 zur Spinsäule und Zentrifuge hinzu, wie zuvor gezeigt.
Nach dem Entsorgen des Durchflusses wird die Spin-Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelrohr gelegt und bei Raumtemperatur bei 16.000 g für zwei Minuten zentrifugiert. Setze die Spin-Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Elutionsrohr. Fügen Sie 50 bis 100 Mikroliter der Lösung C6 in das Zentrum der Filtermembran der Spinsäule hinzu.
Zentrifugiere bei 15.000 g für eine Minute. Lagere das Rohr mit dem Eluent nach dem Entsorgen der Spin-Säule bei vier Grad Celsius. Quantifizieren Sie extrahierte DNA mit einem Fluorometer und einem doppelsträngigen DNA-Weitband-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Für die Analyse von Bakterien und Pilzen wählen Sie spezifische 16S rRNA- und 18S rRNA-Primer aus. Nach dem Auftauen wirbel alle Reagenzien auf Eis. Richte die Digital Droplet Polymerase Chain Reaction, oder ddPCR, ein.
Setzen Sie die Tropfengenerator-Kartusche, oder DG8, in den Patronenhalter. Geben Sie insgesamt 20 Mikroliter des Reaktionsgemisch in jede der Probeschachteln der Kartusche ein. Dann gib 70 Mikroliter Droplet Generation Oil für Evagreen in das gut beschriftete Öl der Kartusche.
Setze die Kartusche in den Tröpfchengenerator und decke sie mit einer Dichtung ab. Übertragen Sie 40 Mikroliter der erzeugten Tröpfchen in jede Welle einer 96-Wellen-halbgeskirtten Platte zur PCR-Amplifikation. Versiegeln Sie die Platte mit einem Plattenversiegler, der für fünf Sekunden auf 180 Grad Celsius eingestellt ist.
Konfigurieren Sie das Thermozyklusprofil und stellen Sie den beheizten Deckel auf 105 Grad Celsius ein. Nach Abschluss der PCR wird die 96-Well-Platte auf den Plattenleser übertragen. Mit QuantaSoft Version 2.1 kann der Schwellenwert der Amplitude so angepasst werden, dass negative und positive Tröpfchen getrennt werden.
Aus jedem Brunnen werden die Parameter bewertet, wie die Anzahl der Genkopien pro Nanogramm DNA, die Gesamtzahl der Genkopien pro Nanogramm der extrahierten DNA, Genkopien pro Gramm Trockengewicht des bei der Extraktion verarbeiteten Bodens und die Zellzahl pro Gramm Trockengewicht des Bodens. Weiter wird der Mikrobielle Biomassekohlenstoff, oder MBC, berechnet, der Bakterien und Pilze pro Gramm Trockengewicht des Bodens pro Bohrloch entspricht. Die dreifache Analyse der Boden-DNA von fünf Standorten ergab durchschnittliche mikrobielle DNA-Konzentrationen von 32 Nanogramm bis 4.590 Nanogramm pro Gramm trockenen Boden pro Probe.
Soil B enthielt die wenigsten 16S-rRNA-Genkopien mit durchschnittlich 8,8 mal 10 in der Potenz von sieben sowie 18S rRNA-Genkopien mit durchschnittlich 4,6 mal 10 pro Potenz von sechs pro Gramm trockenen Boden. Im Gegensatz dazu wies Soil E die höchsten Zahlen von 16S- und 18S-rRNA-Genkopien auf, mit einem Durchschnitt von 4,4 mal 10 in der Potenz von neun und 2,5 mal 10 pro Gramm trockenen Boden, was sich signifikant von allen anderen Proben unterschied. Während die Pilzkopien in den Böden A, B, C und D ähnlich blieben, unterschieden sich die Bakterienzahlen im Boden D signifikant von B und E. Der höchste mikrobielle Anteil wurde in Boden E beobachtet, während der niedrigste mikrobielle Anteil in Proben aus Boden B gefunden wurde, die sich signifikant von A, D und E unterschieden. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Dynamik und Struktur der Bodengemeinschaft anhand der mikrobiellen Biomasse und des Pilz-zu-Bakterien-Verhältnisses zu messen.
Die gleiche Template-DNA, die für tropfenbasierte digitale PCR verwendet wird, kann auch für die DNA-Sequenzierung verwendet werden, um mikrobielle Gemeinschafts- und funktionelle Analysen zu ermöglichen.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein optimierter Arbeitsablauf zur Quantifizierung der bakteriellen und fungalen Abundanz im Boden mittels digitaler Tropfen-PCR (ddPCR) unter Zielsetzung der 16S- und 18S-rRNA-Gene vorgestellt. Das Protokoll ermöglicht die absolute Quantifizierung mikrobieller Genkopien, deren Umrechnung in Zellzahlen sowie die Schätzung des mikrobiellen Biomasse-Kohlenstoffs (MBC). Die Methode wird mit der konventionellen Chloroform-Begasungsextraktion verglichen und an Böden aus fünf weltweit verteilten landwirtschaftlichen Systemen demonstriert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Bodenmikrobiologie
- Molekulare Ökologie
- Umweltwissenschaften
Hintergrund
- Boden ist die größte terrestrische Speicherform für organisches Kohlenstoff, aber in den letzten zwei Jahrhunderten ist signifikanter Kohlenstoffverlust aufgetreten.
- Die mikrobielle Biomasse, insbesondere Pilze und Bakterien, treibt den Kohlenstoff- und Nährstoffkreislauf in Böden an.
- Konventionelle Methoden zur Quantifizierung der mikrobiellen Biomasse weisen Einschränkungen auf, darunter hoher Probenbedarf und Unsicherheiten bei der Umrechnung.
- Es werden genaue, skalierbare und empfindliche Methoden für die Beurteilung der Bodenfruchtbarkeit benötigt.
Zweck der Studie
- Entwicklung und Validierung eines ddPCR-basierten Protokolls zur Quantifizierung der bakteriellen und fungalen Abundanz im Boden.
- Vergleich der mittels ddPCR ermittelten Schätzungen der mikrobiellen Biomasse mit konventionellen Chloroform-Begasungsmethoden.
- Beurteilung der Anwendbarkeit des Protokolls über verschiedene Bodentypen und landwirtschaftliche Systeme hinweg.
Verwendete Methoden
- Extraktion von DNA aus Bodenproben mittels einer Methode mit Glasperlen-Behandlung und Säulchen-Protokoll.
- Quantifizierung der extrahierten DNA mittels Fluorometer und einem Assay-Kit mit großem Messbereich.
- ddPCR mit gezielter Amplifikation der Gene für 16S rRNA (Bakterien) und 18S rRNA (Pilze) unter Verwendung spezifischer Primer.
- Berechnung der Genkopien, Zellzahlen und mikrobiellen Biomasse-Kohlenstoff pro Gramm Trockenboden.
- Vergleich der ddPCR-Ergebnisse mit der Chloroform-Begasungsextraktion und der vollständigen Genomsequenzierung.
Hauptergebnisse
- Die ddPCR ermöglichte eine hochauflösende, absolute Quantifizierung bakterieller und pilzlicher Genkopien in Bodenproben.
- Die Konzentrationen mikrobieller DNA lagen zwischen 32 ng und 4.590 ng pro Gramm Trockenboden je Probe.
- Boden E wies den höchsten mikrobiellen Gehalt auf, während Boden B den niedrigsten aufwies.
- Die ddPCR lieferte breitere und empfindlichere Schätzungen des Verhältnisses von Pilzen zu Bakterien (F:B) im Vergleich zur Ganzgenom-Sequenzierung.
- Die mittels ddPCR bestimmte mikrobielle Biomasse (MBC) zeigte nur eine schwache Korrelation mit Werten aus der Chloroform-Begasungsmethode.
Schlussfolgerungen
- Das ddPCR-Protokoll bietet einen reproduzierbaren, skalierbaren und empfindlichen Ansatz zur Quantifizierung der mikrobiellen Abundanz und Biomasse im Boden.
- Diese Methode ermöglicht eine verbesserte Bewertung ökologischer Indikatoren wie des F:B-Verhältnisses.
- ddPCR kann mit analytischen Untersuchungen der Zusammensetzung kombiniert werden, um die Beurteilung und Forschung zur Bodenqualität voranzubringen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung der mikrobiellen Bodenmasse ist entscheidend, um die ökologischen Treiber des Kohlenstoffkreislaufs und des Nährstoffumsatzes zu verstehen, was Biopharma-Entdeckungsansätze in der Umweltmikrobiomforschung unterstützen kann. Die digitale Tropfen-PCR (ddPCR) ermöglicht eine absolute, hochauflösende Messung der bakteriellen und fungalen Abundanz und trägt so zu fundierten Hypothesentests und der mechanistischen Risikominimierung in der frühen Forschung und Entwicklung bei. Dieser molekulare Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit für translationsorientierte Studien, die mikrobielle Systeme aus Bodenproben einbeziehen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die präzise Quantifizierung mikrobieller Genkopien zur funktionellen Zielvalidierung in Umweltproben.
- Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem bakterielle und pilzliche Beiträge zu Bodenprozessen unterschieden werden.
- Erleichtert die hypothesengetriebene Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur und deren Einfluss auf biogeochemische Zyklen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare Quantifizierung der mikrobiellen Abundanz für nachgeschaltete Screening-Workflows.
- Liefert quantitative Ergebnisse, die für die Assay-Kalibrierung und den Vergleich zwischen verschiedenen Laboren geeignet sind.
- Ermöglicht eine skalierbare Bewertung der mikrobiellen Biomasse über verschiedene Bodentypen hinweg und unterstützt die Wiederverwendung der Plattform.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Maße der mikrobiellen Abundanz mit ökologischen Indikatoren wie dem Pilz-zu-Bakterien-Verhältnis (F:B) für eine translationale Relevanz.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in Studien, die auf Bodenmikrobiomen basieren.
- Verbessert risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem empfindliche, absolute Quantifizierung des mikrobiellen Biomasse-Kohlenstoffs bereitgestellt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser ddPCR-basierte Arbeitsablauf integriert sich in die kontinuierliche Kette von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase für umwelt- und mikrobiombezogene Forschung und Entwicklung.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht eine robuste Hypothesenprüfung und Klärung von Wegen durch Quantifizierung der mikrobiellen Genabundanz und des Biomasse-Kohlenstoffs.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Entwicklung von Assays und Vorbereitung auf Screenings.
- Analytik: Liefert absolute Messungen der Genkopienzahl und Zellanzahl und unterstützt statistische Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Abstimmung mit ökologischen und funktionellen Biomarkern, die für die Bodengesundheit und die Dynamik mikrobieller Gemeinschaften relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine skalierbare, reproduzierbare molekularbiologische Plattform, die an verschiedene Boden- und Umweltsysteme angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in Studien zum Umweltmikrobiom.
- Operativer Wert: Standardisiert die mikrobielle Quantifizierung mit minimalem Probenbedarf und hoher Reproduzierbarkeit.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management in der Forschung und Entwicklung zum Bodenmikrobiom.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Entdeckungsprogrammen, die auf Daten zum Bodenmikrobiom basieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Molekularbiologie und quantitativen PCR-Methoden.
- Benötigt Zugang zu ddPCR-Geräten, fluorometrischer Quantifizierung und Auswertungssoftware.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei der DNA-Extraktion und -Quantifizierung über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann an verschiedene Bodentypen angepasst werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung für unterschiedliche Matrizes.
- Die Interpretation der mikrobiellen Biomassekohlenstoffwerte kann durch Korrekturfaktoren für die Genkopienzahl und die Heterogenität des Bodens beeinflusst werden.
