Fluoreszenzbasierte Kalziumbildgebung in primären menschlichen Atemwegsepithelkulturen mittels automatisierter Zellsegmentierung

Einzelzell-Transkriptomiken zeigen Heterogenität im Atemwegepithel der Mukoviszidose. Wir beabsichtigen zu verstehen, wie zelltypspezifische Funktionen und Veränderungen die Krankheitspathogenese beeinflussen. Die aktuelle Herausforderung besteht darin, Einzelzell-Proteomik und -funktionen genau zu messen.

Dies erfordert noch technische Entwicklung. Zunächst sollten Sie Calu-3-Zellen in T-25-Kolben aufbewahren, die Eagle's Minimum Essential Medium Culture Media enthalten, ergänzt mit 20 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin. Wenn die Zellen etwa 70 % Konfluenz erreichen, waschen Sie sie mit fünf Millilitern PBS.

Nach dem Waschen geben Sie einen Milliliter TrypLE direkt auf die Zellen und stellen Sie die Flasche für 10 bis 15 Minuten in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator und 5 % Kohlendioxid. Anschließend neutralisieren Sie das TrypLE, indem Sie vier Milliliter frisches, vollständiges Kulturmedium hinzufügen und die Zellsuspension gründlich mischen. Die Zellen werden zu einer 96-Well-Platte mit etwa 90 % bis 100 % Konfluenz vernetzt, was etwa 40.000 Zellen pro Bohrloch entspricht.

Lassen Sie die Zellen über Nacht an der 96-Well-Platte haften. Wechseln Sie das Medium täglich und kultivieren Sie die Zellen zwei bis fünf Tage nach der Konfluenz weiter, um die Differenzierung zu ermöglichen. Am Experimenttag waschen Sie die Calu-3-Zellen und inkubieren Sie sie mit geeigneten Farbstoffen.

Anschließend gib pro Bohrloch 100 Mikroliter 2,5 millimolare Probeneciden in Kalziumpuffer verdünnt, um den Farbstoff im zytoplasmatischen Raum zu halten, und wickle die Platte in Alufolie, um sie bis zur Bildgebung vor Licht zu schützen. Für primäre Atemwegszellen. Entfernen Sie das basolaterale Medium aus dem Transwell und waschen Sie die apikale Seite mit 300 Mikrolitern Kalziumpuffer.

Waschen Sie dann die basolaterale Seite mit 750 Mikrolitern Kalziumpuffer. Entfernen Sie den Puffer durch Pipettieren und wiederholen Sie die Spülung auf beiden Seiten. Anschließend werden die Zellen mit 200 Mikrolitern Farbstofflösung auf der apikalen Seite und 600 Mikrolitern auf der basolateralen Seite für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Während der Brützeit bereiten Sie Thapsigargin in Kalziumpuffer verdünnt als dreimal so viel Zwischenbestand vor. Stellen Sie die Konzentration auf sechs Mikromolare an, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolaren im Bohrloch zu erreichen. Nach der Inkubation wird die Farbstofflösung sowohl aus den apikalen als auch aus basolateralen Kompartimenten durch Pipettern entfernt.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit 300 Mikrolitern Calciumpuffer auf der apikalen Seite und 750 Mikrolitern Calciumpuffer auf der basolateralen Seite. Entferne dann den Puffer durch Pipetten. Als Nächstes werden 100 Mikroliter 2,5 millimolare Probeneciden im Kalziumpuffer in das apikale Kompartiment gegeben und 500 Mikroliter derselben Lösung in das basolaterale Kompartiment.

Lassen Sie den Transwell-Einsatz in der Platte, wickeln Sie die gesamte Platte in Alufolie ein, um sie vor Licht zu schützen, und legen Sie die umwickelte Platte für die Bildgebung beiseite. Öffnen Sie die Fidschi-Anwendung. Wählen Sie Datei und wählen Sie Öffnen, um die Videodatei hochzuladen.

Im resultierenden Pop-up-Fenster behalten Sie alle Standardeinstellungen und bestätigen Sie die Auswahl. Wenn gewünscht, passen Sie die Bildanzeige an, indem Sie Bild auswählen, Anpassen auswählen und auf Helligkeitskontrast klicken. Verändern Sie Helligkeit und Kontrast einzelner Fluoreszenzkanäle, um eine optimale Ansicht der Zellen zu erzielen.

Um das Zelltracing zu erleichtern, führen Sie Kanäle zusammen, indem Sie Bild auswählen, Farbe auswählen und auf Kanäle zusammenführen klicken. Im Pop-up-Fenster weisen Sie jedem einzelnen Kanal die entsprechenden Dateien zu und bestätigen Sie die Auswahl. Für das Nachverfolgen wählen Sie Analysieren, Wählen Sie Werkzeuge und öffnen Sie ROI Manager.

Im resultierenden Pop-up-Fenster aktivieren Sie sowohl die Optionen "Alle anzeigen" als auch "Alle anzeigen". Mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug verfolgen Sie sorgfältig einzelne Zellen anhand von Zellgrenzen und der nuklearen Färbung. Drücken Sie dann die T-Tast, um jede nachgezeichnete Zelle zur ROI-Liste hinzuzufügen.

Stellen Sie sicher, dass Zellen in allen vier Ecken des Sichtfelds und in der Mitte des Videos nachgezogen werden. Sobald alle Zellen genau nachverfolgt wurden, klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf Mehr und wählen Sie Multi Measure. Im resultierenden Popup-Fenster drücken Sie OK, um die Messung zu beginnen.

Öffnen Sie die Videodatei in Fidschi. Optimieren Sie die nuklearen und grünen Fluoreszenzkanäle für die Betrachtung mit den Bildanpassungswerkzeugen. Sobald die Kanäle optimiert sind, duplizieren Sie ein einzelnes Bild, indem Sie Bild auswählen und Duplizieren auswählen.

Im resultierenden Pop-up-Fenster deaktivieren Sie Duplikat-Stack und speichern Sie das duplizierte Bild als PNG-Bilddatei. Wiederholen Sie die Frame-Duplizierung für den anderen Kanal, indem Sie Bild auswählen und Duplizieren wählen. Im Popup-Fenster drücken Sie OK und speichern Sie das Bild als PNG-Datei.

Führen Sie die beiden gespeicherten Bilder zusammen, indem Sie Bild auswählen, Farbe auswählen und auf Kanäle zusammenführen klicken. Dann weist jede PNG-Datei dem entsprechenden Kanal zu und bestätigt das Zusammenfassen. Laden Sie das zusammengeführte Bild in die postgraphische Benutzeroberfläche der Zelle hoch, um eine Zellmaske zu erzeugen.

Segmentieren Sie das Bild unter Verwendung der nuklearen Färbung als Kanal eins und die zytoplasmatische Färbung als Kanal zwei, indem Sie das cyto3-Modell auswählen. Speichere nun das generierte Maskenbild als PNG-Datei. Öffne es in Fiji und wandele es in eine TIFF-Datei um.

Öffne schließlich sowohl die Maskendatei als auch die Originalvideodatei in der Calcium-Suite, indem du sie per Drag and Drop in die Software-Oberfläche legst. Klicken Sie auf Daten analysieren, um ein herunterladbares Diagramm und eine herunterladbare CSV-Datei zu erstellen, die normalisierte und rohe Intensitätswerte für alle analysierten Zellen enthält. Die Fluoreszenzintensität, die auf den Ausgangswert normalisiert wurde, nahm im Laufe der Zeit in einzelnen Calu-3-Zellen nach Thapsigargin-Stimulation zu, wenn sie sowohl mit Fluo-4 AM als auch Cal-520 AM gemessen wurde; die maximale calciumabhängige Fluoreszenzaktivierung nach Thapsigargin war bei Calu-3-Zellen mit Cal-520 AM signifikant höher als bei Fluo-4 AM. Ebenso zeigten einzelne primäre Atemwegs- und Bronchialzellen nach der Thapssigargin-Stimulation mit einem der beiden Farbstoffe über die Zeit eine erhöhte normalisierte Fluoreszenz.

Außerdem war die maximale calciumabhängige Fluoreszenzaktivierung in Zellen, die mit Cal-520 AM geladen waren, signifikant höher. Die maschinelle Lernanalyse identifizierte und quantifizierte calciumabhängige Fluoreszenzänderungen in 1.441 einzelnen Zellen aus einem einzigen Sichtfeld. Normalisierte Fluoreszenzspuren, die von der Software erzeugt wurden, zeigten Kalziumantworten für alle 1.441 identifizierten Zellen nach Thapssigargin-Stimulation. Unsere Studien helfen dabei, die Reaktionen verschiedener Zelltypen auf ihre Umgebung zu verstehen, was die Entwicklung gezielter Therapeutika unterstützt.

Unsere Ergebnisse haben das Potenzial, sich auf unterschiedliche Zelltypen zu konzentrieren und bestimmte lebende Zellreaktionen Umweltreizen zuzuordnen. In Zukunft wollen wir untersuchen, wie die zelltypspezifische Signalübertragung bei Krankheiten und gesunden Zellen verändert wird, um die verantwortlichen Typen zu bestimmen.