Name: Fluoreszenzbasierte Kalziumbildgebung in primären menschlichen Atemwegsepithelkulturen mittels automatisierter Zellsegmentierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T12:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie, wie maschinelles Lernen die automatisierte Zellsegmentierung und quantitative Kalziumbildanalyse in primären menschlichen Atemwegsepithelkulturen ermöglicht. Diese Methode unterstützt die Erforschung zelltypspezifischer Krankheitsmechanismen.

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<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Jairaman, A., Prakriya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+airway+epithelial+cells%3A+Current+understanding+and+implications+for+inflammatory+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in airway epithelial cells: Current understanding and implications for inflammatory airway disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (4), 772-783 (2024).</li>
<li>Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+storage+in+health+and+disease%3A+a+dynamic+equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium.</a> Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).</li>
<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), e1796(2008).</li>
<li>Ren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+protects+RPE+cells+from+necroptosis+and+NLRP3+activation+via+promoting+SERCA2-related+intracellular+Ca2%2B+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Melatonin protects RPE cells from necroptosis and NLRP3 activation via promoting SERCA2-related intracellular Ca2+ homeostasis.</a> Phytomedicine. 135, 156088(2024).</li>
<li>Dwivedi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TMEM16A+blockers+benzbromarone+and+MONNA+cause+intracellular+Ca2%2B+release+in+mouse+bronchial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The TMEM16A blockers benzbromarone and MONNA cause intracellular Ca2+ release in mouse bronchial smooth muscle cells.</a> Eur J Pharmacol. 947, 175677(2023).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, e1067(2009).</li>
<li>Hirst, R. A., Harrison, C., Hirota, K., Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+%5BCa2%2B%5Di+in+whole+cell+suspensions+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of [Ca2+]i in whole cell suspensions using fura-2.</a> Methods Mol Biol. 114, 31-39 (1999).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).</li>
<li>Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Swanson, J. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fura-2+secretion+and+sequestration+in+macrophages.+A+blocker+of+organic+anion+transport+reveals+that+these+processes+occur+via+a+membrane+transport+system+for+organic+anions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fura-2 secretion and sequestration in macrophages. A blocker of organic anion transport reveals that these processes occur via a membrane transport system for organic anions.</a> J Immunol. 140 (3), 915-920 (1988).</li>
<li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ca2%2B+indicator+for+long-term+tracking+of+intracellular+calcium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A novel Ca2+ indicator for long-term tracking of intracellular calcium flux.</a> BioTechniques. 70 (5), 271-277 (2021).</li>
<li>Kageyama, T., Ito, T., Tanaka, S., Nakajima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+immunological+barriers+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Physiological and immunological barriers in the lung.</a> Semin Immunopathol. 45 (4), 533-547 (2024).</li>
<li>Quach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+human+fetal+lung+atlas+reveals+the+temporal+dynamics+of+epithelial+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity.</a> Nat Commun. 15 (1), 5898(2024).</li>
<li>Deprez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+human+healthy+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the human healthy airways.</a> Am J Respir Crit Care Med. 202 (12), 1636-1645 (2020).</li>
<li>Prescott, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+in+vitro+air-liquid+interface+culture+models+of+the+human+airway+epithelium+evaluating+cellular+heterogeneity+and+gene+expression+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of in vitro air-liquid interface culture models of the human airway epithelium evaluating cellular heterogeneity and gene expression at single cell resolution.</a> Respir Res. 24 (1), 213(2023).</li>
<li>Gunawardena, T. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophysiological+and+fluorescence-based+measurements+of+modulator+efficacy+in+nasal+epithelial+cultures+derived+from+people+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophysiological and fluorescence-based measurements of modulator efficacy in nasal epithelial cultures derived from people with cystic fibrosis.</a> Cells. 12 (8), 1174(2023).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rescue+of+c.3846G%3EA+%28W1282X%29+in+patient-derived+nasal+cultures+achieved+by+inhibition+of+nonsense-mediated+decay+and+protein+modulators+with+complementary+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Functional rescue of c.3846G>A (W1282X) in patient-derived nasal cultures achieved by inhibition of nonsense-mediated decay and protein modulators with complementary mechanisms of action.</a> J Cyst Fibros. 19 (5), 717-727 (2020).</li>
<li>Terrance, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+nasal+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary human nasal epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 2725, 213-223 (2024).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 115, 115-137 (2002).</li>
<li>Perniss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+succinate%2FSUCNR1-brush+cell+defense+program+in+the+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">A succinate/SUCNR1-brush cell defense program in the tracheal epithelium.</a> Sci Adv. 9 (31), eadg8842(2023).</li>
<li>Sehgal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+sarco%2Fendoplasmic+reticulum+%28ER%29+Ca2%2B-ATPase+by+thapsigargin+analogs+induces+cell+death+via+ER+Ca2%2B+depletion+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+ depletion and the unfolded protein response.</a> J Biol Chem. 292 (48), 19656-19673 (2017).</li>
<li>Cal 520® AM. , AAT Bioquest Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.aatbio.com/products/cal-520-am">https://www.aatbio.com/products/cal-520-am</a> (2025).</li>
<li>Fluo 4® AM. , AAT Bioquest Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552">https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552</a> (2025).</li>
<li>Zaderer, V., Hermann, M., Lass-Flörl, C., Posch, W., Wilflingseder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+the+world+upside-down+in+cellulose+for+improved+culturing+and+imaging+of+respiratory+challenges+within+a+human+3D+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Turning the world upside-down in cellulose for improved culturing and imaging of respiratory challenges within a human 3D model.</a> Cells. 8 (10), 1292(2019).</li>
<li>Becker, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+airway+epithelium+reveals+that+mucociliary+clearance+modulates+SARS-CoV-2+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Live imaging of airway epithelium reveals that mucociliary clearance modulates SARS-CoV-2 spread.</a> Nat Commun. 15 (1), 9480(2024).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>24-Well-Platten&nbsp;</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Transwell-Einsätze&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Flat Clear Bottom, schwarzer Polystyrol-TC-behandelte Mikroplatten</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520 AM</td><td>AAT Bioquest&nbsp;</td><td>21130</td><td>Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C, aufgelöst in DMSO</td></tr><tr><td>Calcium Suite Software</td><td>Der Code kann angefordert werden, indem Sie unsere Laborgruppe kontaktieren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMEM, 1x</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>320-005-CL</td><td>Gelagert bei 4 °C; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>080-450</td><td>Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C</td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&nbsp;</td><td>AAT Bioquest&nbsp;</td><td>20550</td><td>Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C, aufgelöst in DMSO</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP001.5</td><td>Lagerung bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>H3570</td><td>Gelagert bei 4 °C; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Humane epitiheliale kolorektale Adeonkarzinomzelllinie&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-55</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>7786-30-3</td><td>Lagerung bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Mikroschüssel 35 mm, niedriger Glasboden</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>80137</td><td>Bei Raumtemperatur gelagert;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>450-200-EL</td><td>Gelagert bei 4 °C; C</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>3111-010-CL</td><td>Bei Raumtemperatur gelagert;</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>7447-40-7</td><td>Bei Raumtemperatur gelagert;</td></tr><tr><td>Probenecid&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>P36400</td><td>Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C, wasserlöslich&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Bioshop&nbsp;</td><td>SOD004</td><td>Bei Raumtemperatur gelagert;</td></tr><tr><td>Thapsigargin&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>T7458</td><td>Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C aufgelöst in DMSO&nbsp;</td></tr><tr><td>TripLE-Expressenzym (1X), Phenolrot&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>12605010</td><td>Gelagert bei 4 °C; C</td></tr></tbody></table>

fluoreszenzbasierte kalziumbildgebung in primären menschlichen atemwegsepithelkulturen mittels automatisierter zellsegmentierung

Fluorescence-Based Calcium Imaging in Primary Human Airway Epithelial Cultures Using Automated Cell Segmentation

Fluoreszenzbasierte Kalziumbildgebung in primären menschlichen Atemwegsepithelkulturen mittels automatisierter Zellsegmentierung

Calcium signaling is critical in a multitude of biological processes, reinforcing the need to develop methods to study calcium flux in primary tissue. The ...

fluorescence-based-calcium-imaging-primary-human-airway-epithelial

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Hier ein neuer Bereich von Interesse Analyseprotokoll auf Basis von Sortier Best-Fit-Ellipsen zu Regionen positives Signal innerhalb von zwei-dimensionalen Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen zugeordnet wird demonstriert. Dieser Algorithmus kann Forschern ermöglichen, umfassend zu analysieren physiologischen Ca 2 +-Signale mit minimalen Benutzereingaben und Bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Wir stellen ein Protokoll vor, um dynamische Messungen der Atemwegsflüssigkeit pH unter Dünnschichtbedingungen mit einem Plattenleser zu machen.

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

Wir präsentieren ein zweiteiliges Protokoll, das fluoreszierende Calcium-Bildgebung mit In-situ-Hybridisierung kombiniert, so dass der Experimentator Muster der Calciumaktivität mit Genexpressionsprofilen auf einzelzelligem Niveau korrelieren kann.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Expansion und Differenzierung nasaler Epithelzellen zu organotypischen Atemwegsepithelzellmodellen und die Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz mittels Live-Cell-Bildgebung und maßgeschneiderten Skripten.

Sammlung, Expansion und Differenzierung primärer humaner Nasensepithelzellmodelle zur Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz

Das Protokoll beschreibt einen bildgebenden Bioreaktor, der die selektive Entfernung des endogenen Epithels aus der Luftröhre der Ratten und die homogene Verteilung exogener Zellen auf der Lumenoberfläche ermöglicht, gefolgt von einer langfristigen In-vitro-Kultur des Zell-Gewebe-Konstrukts.

Imaging-geführter Bioreaktor zur Erzeugung von biotechnologisch hergestelltem Atemwegsgewebe

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Gefäßverkalkungen tragen wesentlich zur Belastung durch kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der durch vaskuläre glatte Muskelzellen vermittelten Kalziumfällung in vitro durch fluoreszierende Bildgebung.

Eine halbautomatische und reproduzierbare biologisch basierte Methode zur Quantifizierung der Kalziumablagerung in vitro

Wir haben eine Gewebeverarbeitungstechnik entwickelt, bei der ein Vibratom und in Agarose eingebettetes Lungengewebe verwendet werden, um Lungenschnitte zu erzeugen, wodurch hochauflösende Bilder der Lungenarchitektur aufgenommen werden können. Wir verwendeten Immunfluoreszenzfärbung, um die räumliche Proteinexpression anhand spezifischer Lungenstrukturmarker zu beobachten.

Automatisierter Vibratomschnitt von Agarose-eingebettetem Lungengewebe für die Multiplex-Fluoreszenzbildgebung

Hier stellen wir ein neuartiges Gerät vor, das isotrope und uniaxiale Dehnungswellenformen auf Zellen anwendet und gleichzeitig Kultur auf Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit und anpassbaren Proteinmatrizen unterstützt. Diese einfache, wirtschaftliche Plattform ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie mechanische Hinweise die zelluläre Funktion sowohl in grundlegenden Studien als auch in krankheitsrelevanten Kontexten regulieren.

Eine neuartige Plattform für in vitro zelluläre Dehnung und Bildgebung

Erfahren Sie, wie maschinelles Lernen die automatisierte Zellsegmentierung und quantitative Kalziumbildanalyse in primären menschlichen Atemwegsepithelkulturen ermöglicht. Diese Methode unterstützt die Erforschung zelltypspezifischer Krankheitsmechanismen.

Fluoreszenzbasierte Kalziumbildgebung in primären menschlichen Atemwegsepithelkulturen mittels automatisierter Zellsegmentierung (Video) | JoVE Journal

Fluoreszenzbasierte Kalziumbildgebung in primären menschlichen Atemwegsepithelkulturen mittels automatisierter Zellsegmentierung

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